Φαρμακογνωστική μελέτη του φυτού Helleborus cyclophyllus (A. Braun) Boiss. (Ranunculaceae) και διερεύνηση της βιοσύνθεσης των δευτερογενών μεταβολιτών του

Abstract

H. cyclophyllus Boiss. is an endemic plant of the Balkan Peninsula and the only species of the genus Helleborus that grows in Greece. It has five green-yellowish sepals that give it its distinctive uniform green color. Its pharmaceutical properties were known in Ancient Greece, where they called it (ellévoros méllas, ελλέβορος μέλας) or black hellebore. In this study, secondary metabolites were isolated and identified from the aerial parts and the roots of H. cyclophyllus and they were evaluated in silico for their ADMET (absorption, distribution, metabolism, excretion, toxicity) properties and biological activities. More specifically, 7 (VII) bufadienolides: Hellebrin (1), Hellebrigenin-3-O-α-(2-O-β-glucopyranosyl)-quinovopyranoside (2), Deglucohellebrin (3), Kalanchoside A (4), 11α-hydroxyhellebrigenin-3-O-α-rhamnoside (5), (11α-hydroxyhellebrigenin-3-O-α-quinovopyranoside) (6) and Ηellebrigenol-3-O-α-rhamnoside (7); 4 (IV) ecdysones: 20-OH-ecdysone (8), Polypodin B (9), 5-hydroxypodecdysone B (10) and Calonysterone (11); 6 (VI) triterpenic saponins: Helleboroside B (12), (25R)-3β-hydroxyspirost-5-en-1β-yl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside (13), 3-Ο-α-L-rhamnopyranosyl-1-Ο-β-D-(6′-acetyl-glucopyranosyl)-ruscogenin (14), (23S,24S,25S)-23,24-dihydroxyruscogenin-1-O-α-L-4-O-acetylrhamnopyranosyl (12)-β-D-xylopyranosyl (13)-α-L-arabinopyranoside-24-O-β-D-(4-O-tiglic acid)-quinovopyranoside (15), 26-O-β-D-glucopyranosyl-furosta-5,25(27)-diene-1β,3β,22α,26-tetrol-1-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)-O-4-sulfo-α-L-arabinopyranoside] (16), and 26-O-β-D-glucopyranosyl-furosta-5,25(27),20(22)-diene-1β,3β,26-triol-1-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)-O-4-sulfo-α-L-arabinopyranoside] (17); 7 (VII) flavonoids: Quercetin (18), Hyperoside (19), Quercetin-3,7-diglucoside (20), Quercetin 3-O-(2-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranoside (21), Quercetin 3-O-6′′-(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl)-β-D-glucopyranoside (22), Quercetin 3-O-(2‴-caffeoyl sophoroside) (23) και Panasenoside (24), 10 phenolic compounds: 2-phenylethyl-β-primeveroside (25), p-OH benzoic acid (26), p-Coumaric acid (27), Caffeic acid (28), Caffeic acid methyl ester (29), 1-O-caffeoyl-β-D-glucose (30), trans-ferulic acid methyl ester (31), 2-O-feruloyl-L-malate (32), 1-O-(5-hydroxy-4-methylpentanoyl)-6-O-feruloyl-β-D-glucose (33) and Gentisic acid 5-O-β-glucopyranoside (34); as well as another 16 (XVI) compounds: Shikimic acid (35), 2-deoxy-D-ribono-1,4-lactone (36), 4-hydroxymethyl-butyrolactone (37), 5-hydroxymethyl-4,5-dihydrofuranone (38), Sucrose (39), 4-hydroxy-5-[(β-D-glucopyranosyloxy)-methyl]-dihydrofuran-2(3H)-one (40), Citroside A (41), butyl ((((2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)methyl) succinate (42), Glycerol (43), Glyceric acid (44), Stearic acid (45), Palmitic acid methyl ester (46), Uridine (47), β-Adenosine (48), 6-hydroxymethyl-3-pyridinol (49) and Pyroglutamic acid (50). Compounds 2, 5, 6, 7, 15, 17, 33 and 42 were isolated and identified for the first time from natural sources. Furthermore, 12 of the compounds were isolated for the first time from the family Ranunculaceae, 21 compounds were isolated for the first time from the family Helleborus and 27 of them for the first time from the plant Helleborus cyclophyllus. Structure-wise, most of the identified compounds can be administered orally. However, compounds 1, 2, 5-7, 12-17, 20-24 and 39 violate Lipinski’s rule of five, and thus they should be administered parenterally. The compounds did not show any problems regarding their distribution, metabolism or excretion. All the compounds showed slight toxicity on different targets. Compounds 20, 35, 43, 44 and 48 showed multitoxicity and should be administered with caution. The triterpenes exhibited most promising biological activities, notably anticancer activity. Additionally, the total mRNA from the roots of H. cyclophyllus was sequenced and through bioinformatic analysis potential genes involved in the biosynthesis of cholesterol and triterpenes were identified. From those, the gene of cycloartenol synthase (CAS) was functionally characterized in yeast strains AM238 and AM254. Lastly, the amino acid sequence was modeled, and the protein’s active site was identified.

Ο Helleborus cyclophyllus Boiss. είναι ένα τοπικό ενδημικό φυτό της Βαλκανικής Χερσονήσου και το μοναδικό είδος του γένους που αυτοφύεται στην Ελλάδα. Έχει ένα εντυπωσιακό και σχεδόν ενιαίο πράσινο-υποκίτρινο χρώμα, το οποίο οφείλεται στα πέντε πράσινα σέπαλα που υπάρχουν στο άνθος του. Η φαρμακευτική χρήση φυτών αυτού του γένους είναι γνωστή από την αρχαιότητα (ελλέβορος μέλας, Ηelleborus niger). Στη παρούσα μελέτη απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν δευτερογενείς μεταβολίτες από τα υπέργεια τμήματα και τις ρίζες του H. cyclophyllus και μελετήθηκαν in silico ως προς την απορρόφηση, κατανομή, μεταβολισμό, απέκκριση, τοξικότητα και τις πιθανές βιολογικές δράσεις. Συγκεκριμένα, απομονώθηκαν επτά (VII) βουφαδιενολίδια: Hellebrin (1), Hellebrigenin-3-O-α-(2-O-β-glucopyranosyl)-quinovopyranoside (2), Deglucohellebrin (3), Kalanchoside A (4), 11α-hydroxyhellebrigenin-3-O-α-rhamnoside (5), (11α-hydroxyhellebrigenin-3-O-α-quinovopyranoside) (6) και Ηellebrigenol-3-O-α-rhamnoside (7), 4 (IV) εκδυσόνες: 20-OH-ecdysone (8), Polypodin B (9), 5-hydroxypodecdysone B (10) και Calonysterone (11), έξι (VI) τριτερπενικές σαπωνίνες: Helleboroside B (12), (25R)-3β-hydroxyspirost-5-en-1β-yl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside (13), 3-Ο-α-L-rhamnopyranosyl-1-Ο-β-D-(6′-acetyl-glucopyranosyl)-ruscogenin (14), (23S,24S,25S)-23,24-dihydroxyruscogenin-1-O-α-L-4-O-acetylrhamnopyranosyl (12)-β-D-xylopyranosyl (13)-α-L-arabinopyranoside-24-O-β-D-(4-O-tiglic acid)-quinovopyranoside (15), 26-O-β-D-glucopyranosyl-furosta-5,25(27)-diene-1β,3β,22α,26-tetrol-1-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)-O-4-sulfo-α-L-arabinopyranoside] (16) και 26-O-β-D-glucopyranosyl-furosta-5,25(27),20(22)-diene-1β,3β,26-triol-1-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)-O-4-sulfo-α-L-arabinopyranoside] (17), επτά (VII) φλαβονοειδή: Quercetin (18), Hyperoside (19), Quercetin-3,7-diglucoside (20), Quercetin 3-O-(2-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranoside (21), Quercetin 3-O-6′′-(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl)-β-D-glucopyranoside (22), Quercetin 3-O-(2‴-caffeoyl sophoroside) (23) και Panasenoside (24), 10 φαινολικές ενώσεις: 2-phenylethyl-β-primeveroside (25), p-OH benzoic acid (26), p-Coumaric acid (27), Caffeic acid (28), Caffeic acid methyl ester (29), 1-O-caffeoyl-β-D-glucose (30), trans-ferulic acid methyl ester (31), 2-O-feruloyl-L-malate (32), 1-O-(5-hydroxy-4-methylpentanoyl)-6-O-feruloyl-β-D-glucose (33) και Gentisic acid 5-O-β-glucopyranoside (34) καθώς και 16 (XVI) ενώσεις άλλων κατηγοριών: Shikimic acid (35), 2-deoxy-D-ribono-1,4-lactone (36), 4-hydroxymethyl-butyrolactone (37), 5-hydroxymethyl-4,5-dihydrofuranone (38), Sucrose (39), 4-hydroxy-5-[(β-D-glucopyranosyloxy)-methyl]-dihydrofuran-2(3H)-one (40), Citroside A (41), butyl ((((2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)methyl) succinate (42), Glycerol (43), Glyceric acid (44), Stearic acid (45), Palmitic acid methyl ester (46), Uridine (47), β-Adenosine (48), 6-hydroxymethyl-3-pyridinol (49) και Pyroglutamic acid (50). Οι ουσίες 2, 5, 6, 7, 15, 17, 33 και 42 απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν για πρώτη φορά από φυσικό προϊόν. Παράλληλα, 12 ουσίες απομονώθηκαν για πρώτη φορά από την οικογένεια Ranunculaceae, οι 21 ουσίας απομονώθηκαν για πρώτη φορά από το γένος Helleborus και, τέλος, οι 27 ουσίες απομονώθηκαν για πρώτη φορά από το φυτό Helleborus cyclophyllus. Με βάση τη δομή τους, οι περισσότερες ουσίες θα μπορούσαν να χορηγηθούν από του στόματος, ωστόσο, οι ουσίες 1, 2, 5-7, 12-17, 20-24 και 39 παραβιάζουν τον κανόνα του Lipinski, και συνεπώς, θα πρέπει να χορηγηθούν παρεντερικά. Καμία ουσία δεν εμφάνισε σημαντικά προβλήματα κατανομής, μεταβολισμού ή απέκκρισης. Όλες οι ουσίες εμφανίζουν μικρή τοξικότητα, ωστόσο οι ουσίες 20, 35, 43, 44 και 48 εμφανίζουν πολλαπλές τοξικότητες. Ως προς τη βιολογική δράση, τα τριτερπένια (1-17) εμφανίζουν τις πιο ενδιαφέρουσες δράσεις, κυρίως αντικαρκινική δράση. Επιπλέον, αλληλουχήθηκε το ολικό mRNA από τις ρίζες του H. cyclophyllus και με βιοπληροφορική ανάλυση εντοπίστηκαν πιθανά γονίδια που συμμετέχουν στη βιοσύνθεση της χοληστερόλης και των τριτερπενίων. Από αυτά χαρακτηρίστηκε λειτουργικά το γονίδιο της συνθάσης της κυκλοαρτενόλης (CAS) σε ζύμες AM238 και AM254. Τέλος, η αλληλουχία αμινοξέων απεικονίστηκε τρισδιάστατα και επιβεβαιώθηκε το ενεργό κέντρο της πρωτεΐνης.