Functional characterization of insecticide resistance mechanisms in agricultural pests and vectors of diseases using CRISPR/Cas9 genome modifications

Abstract

Controlling populations of arthropods, both vectors of diseases and agricultural pests, remains a continuous challenge, as efforts to mitigate their detrimental consequences in public health and agriculture require sustainable and effective control strategies. Chemical control, which involves the use of insecticides, is the principal and most widely applied method. However, the development and spread of resistance due to the extensive use of insecticides poses a tremendous threat to the long-term efficacy of current control interventions. A better understanding of the molecular determinants that govern insecticidal toxicity and resistance is therefore essential to maintain the effectiveness of chemical control. In particular, the advent of the CRISPR/Cas9 system as genome editing tool has fostered the capabilities to study the role of genes involved in mode of action of insecticides as well as functionally analyse the molecular mechanisms of resistance. In Chapters 1 and 2, my thesis focused on two mosquito species of major public health importance, Anopheles funestus and Anopheles gambiae, which are among the principal malaria vectors in Africa. In Chapter 1, an optimized protocol for precise genetic modifications in An. funestus was developed using the CRISPR/Cas9 system system through the homologous directed repair pathway. This study reports the first successful application of this method, addressing an important methodological gap for this mosquito species. This establishes a foundation for future in vivo functional validation studies of genes and mutations that will contribute to better understanding of the biology, physiology, and mechanisms of toxicity and resistance in this species. Furthermore, the high HDR rates observed suggest that this methodology may be suitable for the development of innovative control methods, such as gene drives.Chapter 2 focused on An. gambiae and the study of a target-site resistance mechanism against pyrethroids. Specifically, from a new set of mutations recently identified by genome wide association study (GWAS) in pyrethroid-resistant individuals of this mosquito species, a haplotype carrying the mutations, V402L and I1527T, in the pyrethroid target gene encoding the Voltage Gated Sodium Channel (vgsc) was selected for functional analysis. For this purpose, I utilized the available genetically modified strain homozygous for the V402L mutation (the Kisumu-V402L/L strain from a previous study) and CRISPR HDR-mediated repair pathway in order to introduce the I1527T mutation and ultimately generate the strain carrying both mutations in homozygosity (402L/L; 1527T/T). However, the homozygous 402L/L; 1527T/T genotype was not viable as adults, since homozygous individuals were detected only during early larval stages. This early-stage lethality suggests a significant fitness cost associated with the combined genotype, 402L/L; 1527T/T. For the assessment of the insecticide resistance profile, deltamethrin bioassays were conducted on individuals carrying the I1527T mutation in heterozygosity on a genetic background homozygous for V402L. The results showed no statistically significant difference in mortality compared with the parental Kisumu-V402L/L strain. These findings suggest that the presence of a single copy of the I1527T allele in combination with V402L mutation in homozygosity did not appear to confer a detectable additional increase in deltamethrin resistance, under the specific experimental conditions. Nevertheless, the inability to obtain viable homozygotes limited phenotypic assessment of this double-mutant haplotype. The following two chapters focused on the agricultural pest Spodoptera frugiperda, an invasive lepidopteran species that has expanded worldwide and which has recently also been detected in Greece. For this pest, a widely used control intervention relies on the deployment of insecticidal proteins (toxins) produced by the bacillus Bacillus thuringiensis (Bt). In Chapter 3, my aim was to evaluate in vivo the contribution of mutations in the extracellular loop 4 (ECL4) of the ABCC2 transporter to the Bt-derived Cry1F toxin resistance in Sp.frugiperda. To generate the genome-edited strain carrying these mutations, I employed the CRISPR/Cas9 homologous direct repair (HDR) pathway. Despite extensive efforts and various alternative designs, the generation of the desired genome-edited strain was not achieved. The G0 HDR-induced mutagenesis rate was estimated to be less than 1%. This low rate posed challenges in obtaining and identifying viable and fertile offspring to propagate the transgenic event, and therefore it was not established the desired homozygous genome-edited strain. In Chapter 4, I investigated whether the tetraspanin gene SfTspC5a, a homolog to HaTspC5 (also known as HaTSPAN1), which has been previously implicated in Cry1Ac toxicity in Helicoverpa armigera, is also involved in Cry1Ac toxicity in Sp. frugiperda. A homozygous genome-edited (knock out) strain was successfully generated through CRISPR/Cas9 non-homologous end joining repair (NHEJ). Bioassays conducted to evaluate the knockout strain against the Cry1Ac toxin resulted in reduced susceptibility, providing the first in vivo evidence for the involvement of the SfTspC5a protein in Cry1Ac toxicity pathway in Sp.frugiperda.

Ο έλεγχος των πληθυσμών αρθροπόδων, τόσο φορέων ασθενειών όσο και εχθρών καλλιεργειών, αποτελεί μια διαρκή πρόκληση καθώς οι συνεχείς ανάγκες για τον περιορισμό των δυσμενών επιπτώσεών τους στη δημόσια υγεία όσο και τη γεωργία απαιτούν την εφαρμογή βιώσιμων και αποτελεσματικών στρατηγικών ελέγχου. Η χημική καταπολέμηση όπου γίνεται χρήση εντομοκτόνων αποτελεί την κυριότερη και συχνότερα εφαρμοζόμενη μέθοδο. Ωστόσο, η εμφάνιση και εξάπλωση του φαινομένου της ανθεκτικότητας, ως αποτέλεσμα της εκτεταμένης χρήσης εντομοκτόνων, απειλεί την αποτελεσματικότητα των υφιστάμενων παρεμβάσεων. Η καλύτερη κατανόηση των μοριακών παραγόντων που καθορίζουν τόσο την εντομοκτόνο δράση όσο και την ανάπτυξη της ανθεκτικότητας είναι σημαντική για τη διατήρηση της αποτελεσματικότητας της χημικής καταπολέμησης. Μάλιστα, η ανακάλυψη του συστήματος CRISPR/Cas9 ως εργαλείο γενετικών τροποποιήσεων, διεύρυνε τις δυνατότητες μελέτης του ρόλου γονιδίων που εμπλέκονται στην τοξική δράση των εντομοκτόνων αλλά και της λειτουργικής ανάλυσης των μοριακών μηχανισμών ανθεκτικότητας. Στα κεφάλαια 1 και 2, επίκεντρο της μελέτης μου αποτέλεσαν δύο είδη κουνουπιών υγειονομικής σημασίας, Anopheles funestus και Anopheles gambiae, τα οποία συγκαταλέγονται μεταξύ των κύριων φορέων της ελονοσίας στην Αφρική. Στο κεφάλαιο 1, αναπτύχθηκε ένα βελτιστοποιημένο πρωτόκολλο στοχευμένων γενετικών τροποποιήσεων στο An. funestus κάνοντας χρήση του συστήματος CRISPR/Cas9 αξιοποιώντας το μονοπάτι επιδιόρθωσης βλαβών μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού. Στην εργασία αυτή, καταγράφεται η πρώτη επιτυχής εφαρμογή του καλύπτοντας ένα σημαντικό μεθοδολογικό κενό για αυτό το είδος κουνουπιού. Έτσι, θέτει τις βάσεις για μελλοντικές μελέτες για τον λειτουργικό χαρακτηρισμό γονιδίων αλλά και μεταλλαγών που θα συμβάλλουν στην καλύτερη κατανόηση της βιολογίας, της φυσιολογίας αλλά και των μηχανισμούς τοξικής δράσης και ανθεκτικότητας εντομοκτόνων ουσιών στον οργανισμό αυτό. Επιπλέον, τα υψηλά ποσοστά γενετικού μετασχηματισμού (transformation) που επιτεύχθηκαν υποδηλώνουν την καταλληλόλητα της μεθοδολογίας αυτής για την ανάπτυξη καινοτόμων μεθόδων καταπολέμησης του, όπως gene drives. Στο κεφάλαιο 2, στόχος ήταν να εκτιμηθεί στο κουνούπι An.gambiae η συνεισφορά ενός μηχανισμού ανθεκτικότητας στόχου έναντι των πυρεθροειδών που αναδείχθηκε από πρόσφατη γονιδιωματική ανάλυση ανθεκτικών ατόμων αυτού του είδους. Συγκεκριμένα, επιλέχθηκε ο απλότυπος όπου συνυπάρχουν οι μεταλλαγές, V402L και I1527T, στο γονίδιο-στόχο των πυρεθροειδών που κωδικοποιεί το κανάλι νατρίου. Για το σκοπό αυτό, αξιοποιήθηκε το διαθέσιμο γενετικά τροποποιημένο στέλεχος που φέρει σε ομοζυγωτία την μεταλλαγή V402L (στέλεχος Kisumu-V402L/L απο προηγούμενη σχετική μελέτη) και το σύστημα CRISPR/Cas9 για την στοχευμένη εισαγωγή της μεταλλαγής Ι1527Τ για τη δημιουργία του στελέχους που θα φέρει και τις δύο αυτές μεταλλαγές σε ομοζυγωτία (402L/L; 1527T/T. Όμως, σε ομοζυγωτία ο γονότυπος αυτός ανιχνεύθηκε μόνο σε προνύμφες πρώιμου σταδίου, ενώ δεν εντοπίστηκαν ποτέ βιώσιμα ενήλικα άτομα. Η παρατηρηθείσα θνησιμότητα υποδηλώνει ότι συγκεκριμένος γονότυπος συνδέεται με σημαντικό κόστος προσαρμοστικότητας. Επιπλέον, βιοδοκιμές με δελταμεθρίνη σε άτομα που έφεραν τη μεταλλαγή I1527T σε ετεροζυγωτία, σε γενετικό υπόβαθρο ομόζυγο για τη V402L, δεν ανέδειξαν στατιστικά σημαντική αύξηση της ανθεκτικότητας σε σύγκριση με το πατρικό στέλεχος Kisumu-V402L/L. Τα αποτελέσματα αυτά, υποδηλώνουν ότι η παρουσία ενός μόνο αλληλομόρφου που φέρει τη μεταλλαγή Ι1527Τ συνδυαστικά με την μεταλλαγή V402L σε ομοζυγωτία δεν φάνηκε να προσδίδει ανιχνεύσιμη πρόσθετη αύξηση των επιπέδων ανθεκτικότητας στην δελταμεθρίνη υπό τις συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες. Ωστόσο, η αδυναμία δημιουργίας αμιγούς ομόζυγου στελέχους λόγω της πρώιμης θνησιμότητας περιόρισε τις δυνατότητες για την φαινοτυπική αξιολόγηση του συνδυαστικού αυτού γονοτύπου. Στα δύο επόμενα κεφάλαια, η έρευνά μου επικεντρώθηκε στο λεπιδόπτερο Spodoptera frugiperda, ένα έντομο εχθρό καλλιεργειών με παγκόσμια εξάπλωση, που πρόσφατα εντοπίστηκε και στην Ελλάδα. Πιο συγκεκριμένα, εστίασα στην ευρέως διαδεδομένη μέθοδο καταπολέμησής του με τη χρήση εντομοκτόνων πρωτεϊνών (τοξινών) από το βάκιλο Bacillus thuringiensis (Bt). Στόχος του κεφαλαίου 3, ήταν η in vivo αξιολόγηση στο Sp.frugiperda της συμβολής στην ανθεκτικότητας έναντι της τοξίνης Cry1F των μεταλλάξεων που εντοπίζονται στον εξωκυττάριο βρόχο 4 της πρωτεΐνης-μεταφορέα ABCC2. Για τη δημιουργία του γενετικά τροποποιημένου στελέχους που θα φέρει τις μεταλλαγές αυτές, χρησιμοποίησα το σύστημα CRISPR/Cas9, στοχεύοντας το μονοπάτι επιδιόρθωσης μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού. Ωστόσο, παρά τις εκτενείς προσπάθειες και τα διάφορα εναλλακτικά σχέδια πειραματικής υλοποίησης που δοκιμάστηκαν, δεν κατέστη δυνατή η δημιουργία του επιθυμητού στελέχους. Ο χαμηλός ρυθμός μεταλλαξιγέννεσης μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού στα G0 άτομα εκτιμήθηκε χαμηλότερα από 1%. Το ποσοστό αυτό λειτούργησε ανασταλτικά στον εντοπισμό και διαλογή των επιθυμητών γενετικά τροποποιημένων, βιώσιμών και γόνιμων απογόνων, παρεμποδίζοντας την ανάκτηση και κληροδότηση του επιθυμητού αλληλομόρφου στις ακόλουθες γενιές και, κατά συνέπεια, τη δημιουργία του επιθυμητού ομόζυγου γενετικά τροποποιημένου στελέχους. Στο κεφάλαιο 4, διερεύνησα εάν το γονίδιο της τετρασπανίνης SfTspC5a, ομόλογο του HaTspC5 (γνωστό και ως HaTSPAN1) το οποίο έχει βρεθεί να εμπλέκεται στο μονοπάτι τοξικότητας της τοξίνης Cry1Ac στο λεπιδόπτερο Helicoverpa armigera, εμπλέκεται επίσης στο μονοπάτι της τοξικής δράσης της Cry1Ac στο Sp.frugiperda. Δημιουργήθηκε επιτυχώς ένα ομόζυγο γενετικά τροποποιημένο στέλεχος στο οποίο πραγματοποιήθηκε στοχευμένη αδρανοποίηση του γονιδίου αυτού (knockout) εφαρμόζοντας το σύστημα CRISPR/Cas9 μέσω του μη-ομόλογου ανασυνδυασμού μονοπατιού επιδιόρθωσης. Βιοδοκιμές έναντι της τοξίνης Cry1Ac έδειξαν μειωμένη ευαισθησία του στελέχους αυτού, υποδηλώνοντας για πρώτη φορά τη συμμετοχή της πρωτεΐνης SfTspC5a στο μονοπάτι τοξικότητας της Cry1Ac στο Sp.frugiperda.