Investigating the effects of platelets in diet-induced obesity and insulin resistance during atherosclerosis regression

Abstract

Cardiovascular diseases remain the leading cause of death globally, with atherosclerotic cardiovascular disease (ASCVD) being a significant contributor. Atherosclerosis, characterized by lipid accumulation and chronic inflammation within arterial walls, progresses through endothelial dysfunction, which facilitates lipid deposition and lesion formation. These lesions evolve into plaques that can rupture, leading to acute events like heart attacks and strokes. Despite advancements in lipid-lowering therapies, such as statins, residual cardiovascular risk remains particularly high in individuals with metabolic disorders, including obesity and type 2 diabetes (T2D). This highlights the need to investigate additional contributors to ASCVD, including platelet-mediated inflammatory pathways.Platelets, primarily known for their roles in hemostasis and thrombosis, also play pivotal roles in atherosclerosis by interacting with immune cells, forming aggregates, and exacerbating inflammation. Activated platelets promote leukocyte recruitment, enhance pro-inflammatory phenotypes, and modulate the microenvironment within atherosclerotic plaques. Platelet activation further amplifies inflammation by facilitating LDL uptake by macrophages, leading to foam cell formation, and enhancing IL-1β production through NF-κB signaling. This study examines the role of platelets in atherosclerosis regression, focusing on their impact on macrophage phenotypes and plaque composition during lipid-lowering treatment. The central hypothesis was that platelet activation in a diet-induced obesity and insulin resistance (DIO/IR) model would hinder atherosclerosis regression. Using this model, I explored the effects of platelet depletion on macrophages and plaque dynamics through single-cell transcriptomics, immunohistology, and functional assays.Lipid-lowering therapy did not significantly alter platelet activation or the metabolic characteristics of diabesity in mice. Specifically, obese mice undergoing lipid-lowering treatment retained IR and impaired glucose tolerance (iGT), regardless of platelet presence. Upon platelet depletion, key findings revealed notable changes in plaque composition and macrophage phenotypes. Plaque morphometric analysis showed improvements, including increased collagen area -a marker of plaque stability- while the CD68+ macrophage area remained constant. Single-cell RNA sequencing (scRNA seq) and immunostaining identified an increase in Fcgr4+ macrophages, a reparative population associated with enhanced phagocytic activity and reduced pro-inflammatory signaling, and a reduction in foamy macrophages, which exhibited a less inflammatory phenotype. These changes correlated with decreased necrotic core areas in platelet-deficient mice, highlighting the role of Fcgr4+ macrophages in promoting plaque stability. Collectively, these findings demonstrate the reparative shifts in plaque microenvironments induced by platelet depletion during lipid-lowering therapy, contributing to a more stable atherosclerotic plaque. Interestingly, platelet depletion did not affect circulating monocyte or neutrophil counts, suggesting that its impact is localized to the plaque microenvironment. The disruption of monocyte-platelet and neutrophil-platelet aggregates (MPA and NPA) in circulation likely contributes to these localized changes. Ex vivo experiments revealed that LPS stimulation inversely regulated Fcgr4 expression in macrophages while promoting pro-inflammatory cytokine production, underscoring a nuanced role for Fcgr4+ macrophages in plaque remodeling. Additional analyses revealed systemic effects of platelet depletion, including splenomegaly and alterations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Increased common myeloid progenitors (CMPs) in the spleen and bone marrow suggest compensatory responses to platelet loss, although these changes did not translate into altered circulating platelet or red blood cell counts. These findings underscore the complexity of platelet-mediated regulation of immune cell dynamics. Clinically, these results have significant implications for treating ASCVD, especially in high-risk populations such as those with obesity and T2D. Platelet-targeted therapies, combined with lipid-lowering agents, could synergistically reduce cardiovascular risk by addressing both lipid levels and inflammation. By elucidating the molecular mechanisms underlying platelet-leukocyte interactions, this study highlights the therapeutic potential of targeting platelets to enhance inflammation resolution and plaque stability in ASCVD. In conclusion, this work demonstrates that platelet depletion during lipid-lowering therapy significantly influences plaque macrophage phenotypes, fostering a reparative environment and stabilizing atherosclerotic plaques. These findings provide a comprehensive framework for understanding the interplay between platelets and immune cells in atherosclerosis regression and pave the way for developing innovative therapeutic strategies to reduce the burden of ASCVD in diverse patient populations.

Οι καρδιαγγειακές παθήσεις παραμένουν η κύρια αιτία θανάτου παγκοσμίως, με την αθηροσκληρωτική καρδιαγγειακή νόσο (ASCVD) να αποτελεί σημαντικό παράγοντα αυτής της επιβάρυνσης. Η αθηροσκλήρωση, η οποία χαρακτηρίζεται από συσσώρευση λιπιδίων και χρόνια φλεγμονή στα τοιχώματα των αρτηριών, εξελίσσεται μέσω της δυσλειτουργίας του ενδοθηλίου, η οποία διευκολύνει την εναπόθεση λιπιδίων και τον σχηματισμό βλαβών. Αυτές οι βλάβες εξελίσσονται σε πλάκες που μπορεί να ραγίσουν, οδηγώντας σε οξέα επεισόδια, όπως καρδιακές προσβολές και εγκεφαλικά επεισόδια. Παρά την πρόοδο στις θεραπείες μείωσης λιπιδίων, όπως οι στατίνες, ο υπολειπόμενος καρδιαγγειακός κίνδυνος παραμένει ιδιαίτερα υψηλός σε άτομα με μεταβολικές διαταραχές, όπως η παχυσαρκία και ο διαβήτης τύπου 2 (T2D). Αυτό υπογραμμίζει την ανάγκη μελέτης επιπρόσθετων παραγόντων που συμβάλλουν στην ASCVD, συμπεριλαμβανομένων των φλεγμονωδών μονοπατιών που μεσολαβούν μέσω των αιμοπεταλίων. Τα αιμοπετάλια, γνωστά για τους ρόλους τους στην αιμόσταση και τη θρόμβωση, συμβάλλουν επίσης σημαντικά στην αθηροσκλήρωση μέσω της αλληλεπίδρασής τους με ανοσοκύτταρα, της δημιουργίας συσσωματωμάτων και της επιδείνωσης της φλεγμονής. Τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια προάγουν τη στρατολόγηση λευκοκυττάρων, ενισχύουν τα προφλεγμονώδη φαινότυπα και ρυθμίζουν το μικροπεριβάλλον στις αθηροσκληρωτικές πλάκες. Η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων ενισχύει περαιτέρω τη φλεγμονή διευκολύνοντας την πρόσληψη LDL από μακροφάγα, οδηγώντας στο σχηματισμό αφρωδών κυττάρων, και ενισχύοντας την παραγωγή IL-1β μέσω της σηματοδότησης NF-κB.Η παρούσα μελέτη διερευνά τον ρόλο των αιμοπεταλίων στην αναστροφή της αθηροσκλήρωσης, ιδιαίτερα την επίδρασή τους στα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των μακροφάγων και τη σύνθεση των πλακών κατά τη διάρκεια της θεραπείας μείωσης λιπιδίων. Η υπόθεση αυτής της διδακτορικής διατριβής ήταν ότι η ενεργοποίηση αιμοπεταλίων από το DIO/IR θα είναι επιζήμια για την αναστροφή της αθηροσκλήρωσης.Χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ποντικού αθηροσκλήρωσης που προκαλείται από παχυσαρκία λόγω διατροφής και αντίσταση στην ινσουλίνη (DIO/IR), διερεύνησα τις επιδράσεις της μείωσης των αιμοπεταλίων στα μακροφάγα και τη δυναμική των πλακών μέσω single cell RNA αλληλούχιση (scRNA seq), ανοσοϊστολογικής ανάλυσης και λειτουργικών δοκιμών. Η θεραπεία μείωσης λιπιδίων δεν επηρέασε την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων ή τα μεταβολικά χαρακτηριστικά της διαβητικής παχυσαρκίας στα ποντίκια. Συγκεκριμένα, τα παχύσαρκα ποντίκια υπό θεραπεία μείωσης λιπιδίων διατήρησαν τα χαρακτηριστικά της αντίστασης στην ινσουλίνη (IR) και της μειωμένης ανοχής στη γλυκόζη (iGT), ανεξαρτήτως παρουσίας αιμοπεταλίων. Με την μείωση των αιμοπεταλίων, τα κύρια ευρήματα αποκάλυψαν σημαντικές αλλαγές στη σύνθεση των πλακών και στα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των μακροφάγων. Η ανάλυση της σύνθεσης των πλακών έδειξε βελτιώσεις στη μορφομετρία των πλακών, όπως αυξημένη περιοχή κολλαγόνου—ένας δείκτης σταθερότητας των πλακών—ενώ η περιοχή των CD68+ μακροφάγων παρέμεινε αμετάβλητη. Η scRNA-seq και η ανοσοϊστολογική χρώση αποκάλυψαν αύξηση στα Fcgr4+ μακροφάγα, έναν επανορθωτικό πληθυσμό που σχετίζεται με ενισχυμένη φαγοκυτταρική δραστηριότητα και μειωμένη προφλεγμονώδη σηματοδότηση, και λιγότερα αφρώδη μακροφάγα, τα οποία εμφάνισαν λιγότερο φλεγμονώδη φαινότυπο. Αυτές οι αλλαγές συνοδεύτηκαν από μειωμένη περιοχή νεκρωτικού πυρήνα σε ποντίκια με έλλειψη αιμοπεταλίων, υπογραμμίζοντας τον ρόλο των Fcgr4+ μακροφάγων στην προώθηση της σταθερότητας των πλακών. Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα αναδεικνύουν τις επανορθωτικές αλλαγές στο μικροπεριβάλλον των πλακών που προκαλούνται από την μείωση των αιμοπεταλίων κατά τη θεραπεία μείωσης λιπιδίων, συμβάλλοντας σε πιο σταθερές αθηροσκληρωτικές πλάκες. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η μείωση των αιμοπεταλίων δεν επηρέασε τον αριθμό των κυκλοφορούντων μονοκυττάρων ή ουδετερόφιλων, υποδηλώνοντας ότι η επίδρασή τους εντοπίζεται τοπικά στο μικροπεριβάλλον της πλάκας. Η μείωση των συσσωματωμάτων μονοκυττάρων-αιμοπεταλίων και ουδετερόφιλων-αιμοπεταλίων στην κυκλοφορία πιθανότατα συμβάλλει σε αυτές τις τοπικές αλλαγές. Τα ex vivo πειράματα αποκάλυψαν ότι η διέγερση με LPS αντιστρόφως ρύθμισε την έκφραση του Fcgr4 στους μακροφάγους ενώ προώθησε την παραγωγή προφλεγμονωδών κυτοκινών, αναδεικνύοντας τον πολύπλοκο ρόλο των Fcgr4+ μακροφάγων στην αναμόρφωση της πλάκας. Πρόσθετες αναλύσεις αποκάλυψαν συστημικές επιδράσεις από την μείωση των αιμοπεταλίων, συμπεριλαμβανομένης της σπληνομεγαλίας και των αλλαγών στα αιμοποιητικά βλαστικά και προγονικά κύτταρα (HSPCs). Αυξημένα κοινά μυελοειδή προγονικά κύτταρα (CMPs) στον σπλήνα και το μυελό των οστών υποδεικνύουν αντισταθμιστικές αποκρίσεις στην απώλεια αιμοπεταλίων, ωστόσο αυτές οι αλλαγές δεν μετουσιώθηκαν σε αλλαγές στον αριθμό των κυκλοφορούντων αιμοπεταλίων ή ερυθρών αιμοσφαιρίων. Αυτά τα ευρήματα αναδεικνύουν την πολυπλοκότητα της ρύθμισης της δυναμικής των ανοσοκυττάρων από τα αιμοπετάλια. Κλινικά, αυτά τα αποτελέσματα έχουν σημαντικές επιπτώσεις στη θεραπεία της ASCVD, ειδικά σε πληθυσμούς υψηλού κινδύνου όπως αυτοί με παχυσαρκία και T2D. Οι στοχευμένες θεραπείες κατά των αιμοπεταλίων, σε συνδυασμό με θεραπείες προσ μείωσης λιπιδίων, θα μπορούσαν να μειώσουν συνεργιστικά τον καρδιαγγειακό κίνδυνο αντιμετωπίζοντας τόσο τα επίπεδα λιπιδίων όσο και τη φλεγμονή. Παρέχοντας πληροφορίες για τους μοριακούς μηχανισμούς αλληλεπίδρασης αιμοπεταλίων-λευκοκυττάρων, η μελέτη αυτή υπογραμμίζει τη θεραπευτική δυνατότητα στοχεύοντας στα αιμοπετάλια για την ενίσχυση της επίλυσης της φλεγμονής και της σταθερότητας των πλακών στην ASCVD. Συμπερασματικά, αυτή η εργασία καταδεικνύει ότι η δραστική μείωση των αιμοπεταλίων κατά τη θεραπεία μείωσης λιπιδίων επηρεάζει σημαντικά τον φαινότυπο των μακροφάγων της πλάκας, προάγοντας ένα επανορθωτικό περιβάλλον και σταθεροποιώντας τις αθηροσκληρωτικές πλάκες. Αυτά τα ευρήματα παρέχουν ένα ολοκληρωμένο πλαίσιο για την κατανόηση της αλληλεπίδρασης αιμοπεταλίων και ανοσοκυττάρων στην αναστροφή της αθηροσκλήρωσης και ανοίγουν τον δρόμο για την ανάπτυξη καινοτόμων θεραπευτικών στρατηγικών για τη μείωση του βάρους της ASCVD σε διαφορετικούς πληθυσμούς ασθενών.