Metabolomics analysis and determination of bioactive alkannins and shikonins in Boraginaceae

Abstract

Metabolomics is the most recent addition to the glossary of systems biology omics technologies seeking to provide a holistic view of complex biological systems. Amongst plants, the medicinal variety is of particular interest to humans for reasons requiring little further elaboration. The Boraginaceae family of plants contains numerous representatives of medicinal plants in its genera such as Alkanna, Echium and Lithospermum. Individual species biosynthesize pharmaceutically-relevant secondary metabolites in isohexenylnaphthazarins alkannin/shikonin and their derivatives, with a stark contrast to this brought by the presence of (hepato-)toxic pyrrolizidine alkaloids in the same plant (root) tissues. A combination of untargeted and targeted metabolomics approaches was utilized in the research, with the development and subsequent use of high-resolution mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy methods, with high-performance liquid chromatography methods tailored and utilized for quantitation of alkannins and shikonins. Medicinal compounds, their biosynthetic pathways, influence of the different factors on their abundance and correlations were mainly studied in the context of Alkanna tinctoria and Lithospermum officinale. The former provided information regarding the potential industrial production of medicinal compounds via determination of optimal plant harvest time. The latter was used to gauge the microbial enhancement of secondary metabolite production, the first such research effort involving alkannin/shikonin and their derivatives. Echium vulgare provided insight related to pyrrolizidine alkaloids, in particular the changes in abundance related to plant growth that further yielded a hypothesis on the localization of alkaloid biosynthesis in the species. Untargeted metabolomics revealed influences of different factors on root metabolomes in the three genera. Metabolites most influenced by the respective factors such as plant developmental stage, soil type, location or soil pH value were uncovered through statistical analysis methods. Some of the discoveries included the potential connection of amino acid abundance in E. vulgare and soil acidity and the contrast between rosette and flowering stage plant root metabolite abundance in the same species. Different microbial treatments were compared in terms of the metabolome modulation they exerted on L. officinale. Different mechanisms of modulation of isohexenylnaphthazarin biosynthetic pathways were noticed in the cases of individual microbial strains. The conclusions regarding the enhancement of production of medicinal compounds could easily be applied to further improve the yield of these metabolites by e.g. combining the microbial strains found to be most beneficial, with further involvement of hormones such as abscisic acid. Attempts were made to find strong correlations between species of microbes and metabolites by integrating omics approaches for the study of cultivated A. tinctoria and wild E. vulgare. In this multidisciplinary effort it was found the metabolome was overwhelmingly affected by the plant development and showed very little influence of soil type, in the case of the microbiome the opposite rang true. Nevertheless, these were the first integrated microbiome-metabolome studies on Boraginaceae plant species. Humble contributions were made with annotations of numerous compounds that were previously not reported in the respective species, including one pyrrolizidine alkaloid and its N-oxide in E. vulgare and two methoxy derivatives of alkannin/shikonin in A. tinctoria.

Η μεταβολομική είναι η πιο πρόσφατη προσθήκη στο γλωσσάριο των ομικών τεχνολογιών της βιολογίας συστημάτων, και αποσκοπεί στο να προσδώσει μία ολιστική εικόνα των σύνθετων βιολογικών συστημάτων. Η οικογένεια Boraginaceae περιλαμβάνει πλήθος φαρμακευτικών φυτών που ανήκουν - μεταξύ άλλων - στα γένη Alkanna, Echium και Lithospermum. Ορισμένα είδη αυτών, βιοσυνθέτουν φαρμακολογικά σημαντικούς δευτερογενείς μεταβολίτες με τη μορφή των ισοεξενυλοναφθαζαρινών αλκαννίνη/σικονίνη και των παραγώγων τους, σε πλήρη αντίθεση με την παρουσία (ηπατο-)τοξικών πυρρολιζιδινικών αλκαλοειδών στους ίδιους ακριβώς ιστούς (ριζικό σύστημα). Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε ένας συνδυασμός στοχευμένης και μη στοχευμένης μεταβολομικής προσέγγισης, με την ανάπτυξη και συνακόλουθη χρήση μεθόδων φασματομετρίας μάζας υψηλής ανάλυσης και φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού, και εφαρμόζοντας μεθόδους υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης για την ποσοτικοποίηση των αλκανιννών και σικονινών. Οι φαρμακολογικά ενεργές ενώσεις, οι βιοσυνθετικές οδοί τους, καθώς και η επίδραση των διαφόρων παραγόντων στην αφθονία και τις συσχετίσεις τους, μελετήθηκαν κυρίως στο πλαίσιο των φυτών Alkanna tinctoria και Lithospermum officinale. Το πρώτο παρείχε πληροφορίες για πιθανή βιομηχανική παραγωγή των φαρμακευτικά δραστικών μορίων μέσω του προσδιορισμού του βέλτιστου χρόνου συγκομιδής. Το δεύτερο αξιοποιήθηκε για τη μέτρηση της μικροβιακής ενίσχυσης στην παραγωγή των δευτερογενών μεταβολιτών, και αποτελεί την πρώτη τέτοια ερευνητική απόπειρα που περιλαμβάνει την αλκαννίνη/σικόνη και τα παράγωγά τους. Το είδος Echium vulgare παρείχε χρήσιμες πληροφορίες σχετικά με τα πυρρολιζιδινικά αλκαλοειδή οδηγώντας σε διατύπωση υπόθεσης σχετικά με το πού πραγματοποιείται η βιοσύνθεση των αλκαλοειδών στο είδος αυτό. Η μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση ανέδειξε την επίδραση διαφορετικών παραγόντων στο ριζικό μεταβόλωμα των τριών γενών. Οι μεταβολίτες που επηρεάστηκαν περισσότερο από τους υπό μελέτη παράγοντες, όπως το στάδιο της ανάπτυξης των φυτών, τον τύπο του εδάφους, την τοποθεσία, καθώς και το pH του εδάφους, αναδείχθηκαν με την εφαρμογή μεθόδων στατιστικής ανάλυσης. Μερικά από τα ευρήματα περιλάμβαναν την πιθανή σύνδεση μεταξύ της αφθονίας αμινοξέων και της οξύτητας του εδάφους, καθώς και τις διακυμάνσεις της αφθονίας των μεταβολιτών στις ρίζες του E. vulgare κατά τα διάφορα στάδια ανάπτυξης. Διάφοροι μικροβιακοί εμβολιασμοί εξετάστηκαν ως προς την επίδρασή τους στο μεταβόλωμα του L. officinale. Διαφορετικοί μηχανισμοί ρύθμισης των βιοσυνθετικών μονοπατιών της ισοεξενυλοναφθαζαρίνης παρατηρήθηκαν σε μεμονωμένα μικροβιακά στελέχη. Τα συμπεράσματα σχετικά με την ενίσχυση της παραγωγής των φαρμακολογικά ενεργών ενώσεων θα μπορούσαν να εφαρμοστούν για την περαιτέρω αύξηση της απόδοσης αυτών των μεταβολιτών, συνδυάζοντας, για παράδειγμα, τα πιο ωφέλιμα μικροβιακά στελέχη, και την επιπρόσθετη χρήση ορμονών, όπως το αμπσισικό οξύ. Έγιναν προσπάθειες ανεύρεσης ισχυρών συσχετίσεων μεταξύ μικροβιακών ειδών και μεταβολιτών, ενσωματώνοντας ομικές προσεγγίσεις για τη μελέτη των ειδών A. tinctoria καλλιέργειας και E. vulgare από τη φύση. Σε αυτή τη διεπιστημονική προσπάθεια διαπιστώθηκε ότι το μεταβόλωμα επηρεάζεται έντονα από την ανάπτυξη των φυτών και ελάχιστα από τον τύπου του εδάφους, ενώ στην περίπτωση του μικροβιώματος, φάνηκε να ισχύει το ακριβώς αντίθετο. Ωστόσο, αυτή ήταν η πρώτη συνδυαστική μελέτη μικροβιώματος-μεταβολώματος σε είδη της οικογένειας Boraginaceae. Μια ταπεινή συνεισφορά πραγματοποιήθηκε μέσω της επισήμανσης πολυάριθμων ενώσεων που δεν έχουν αναφερθεί στο παρελθόν για τα συγκεκριμένα είδη, συμπεριλαμβανομένου ενός πυρρολιζιδινικού αλκαλοειδούς και του αντίστοιχου οξειδίου αζώτου στο E. vulgare, καθώς και δύο μεθοξυ- παραγώγων αλκαννίνης/σικονίνης στο φυτό A. tinctoria.