Study of tissues and their structural protein components using spectroscopic techniques

Abstract

This doctoral Thesis investigates the hierarchical structure, chemistry, and mechanics of structural proteins and keratinous tissues through an integrated application of vibrational and X-ray–based spectroscopic techniques. Following a comprehensive introduction to structural proteins, amino acids, protein folding motifs, keratin intermediate filaments, collagen triple helices, lipids, and trace elements in biological tissues (Chapter 1), the theoretical background of Raman spectroscopy, high-pressure methods, Small-Angle X-ray Scattering (SAXS), X-ray Fluorescence (XRF), and X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) is presented (Chapter 2), together with detailed experimental procedures, sample preparation, and data-processing protocols (Chapter 3). High-pressure Raman spectroscopy is employed to probe the molecular response of collagen and α-keratin under hydrostatic compression up to 4 GPa (Chapter 4), revealing reversible pressure-induced shifts in CH deformation, CH stretching, and amide I vibrational modes. In keratin extracted from sheep wool, the amide I mode exhibits a positive pressure dependence, indicative of peptide bond strengthening, in contrast to collagen, which displays a negative slope, reflecting fundamentally different hydrogen-bonding architectures and mechanical roles in these fibrous proteins. The mechanical response of human hair under uniaxial tensile strain is examined using Raman spectroscopy and morphological analysis (Chapter 5), demonstrating a direct correlation between macroscopic elongation and cuticular deformation, strain-induced conformational changes in disulfide crosslinks, and the critical role of the cuticular cell membrane complex in enabling scale gliding while preserving structural integrity. A comprehensive multiscale study of human hair (Chapter 6) combines μ-XRF mapping, Zn K-edge XANES, and SAXS recorded from the same sample spot to reveal robust intermediate-filament lattice organization alongside donor-dependent chemical heterogeneity, showing that nanoscale filament spacing correlates with Zn coordination chemistry rather than bulk sulfur content. Extending this correlative approach to human nails (Chapter 7), spatially resolved XRF, XANES, SAXS, and Raman analyses uncover pronounced chemical and structural heterogeneity in psoriatic and dystrophic nails, including disrupted Zn–S chemistry, altered Zn ligand environments, expanded filament lattices, and increased matrix disorder, providing a unified chemical–structural explanation for compromised mechanical integrity. Complementary investigations of canine nails (Chapter 8) further elucidate species-dependent variations in keratin organization and metal coordination. Overall (Chapter 9), this Thesis demonstrates that subtle molecular-scale variations in bonding, trace-element coordination, and lipid composition are intimately linked to nanoscale and mesoscale structural organization in keratinous tissues, underscoring the power of correlative, multi-technique spectroscopy in revealing the biochemical and biophysical foundations of tissue mechanics and pathology.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζεται στη μελέτη της ιεραρχικής δομής, της χημικής σύστασης και των μηχανικών ιδιοτήτων δομικών πρωτεϊνων και κερατινωδών ιστών μέσω της συνδυαστικής εφαρμογής φασματοσκοπικών τεχνικών και τεχνικών ακτίνων Χ. Αρχικά παρουσιάζεται μια εκτενής εισαγωγή στις δομικές πρωτεΐνες, τα αμινοξέα και τον ρόλο τους, τους μηχανισμούς πρωτεϊνικής αναδίπλωσης, τη δομή της τριπλής έλικας του κολλαγόνου, τα ενδιάμεσα ινίδια κερατίνης, καθώς και τη σημασία των λιπιδίων και των ιχνοστοιχείων σε ανθρώπινους κερατινώδεις ιστούς όπως η τρίχα και το νύχι (Κεφάλαιο 1). Ακολουθεί η θεωρητική περιγραφή των πειραματικών τεχνικών Raman, Raman υψηλών πιέσεων, Μικρής Γωνίας Σκέδασης Ακτίνων-Χ (SAXS), Φθορισμού Ακτίνων-Χ (XRF) και Φασματοσκοπίας Λεπτής Υφής Ακμής Απορρόφησης Ακτίνων-Χ (XANES), καθώς και η αναλυτική παρουσίαση της πειραματικής μεθοδολογίας, της προετοιμασίας δειγμάτων και των διαδικασιών επεξεργασίας δεδομένων (Κεφάλαια 2 και 3). Η απόκριση του κολλαγόνου και της α-κερατίνης σε υδροστατική πίεση έως 4 GPa διερευνάται με φασματοσκοπία Raman (Κεφάλαιο 4), αποκαλύπτοντας αντιστρέψιμες μεταβολές στις δονήσεις παραμόρφωσης και τάσης δεσμών C–H καθώς και του αμιδίου Ι, με την κερατίνη να εμφανίζει θετική εξάρτηση της τελευταίας με την πίεση, σε αντίθεση με το κολλαγόνο, γεγονός που αποδίδεται σε θεμελιώδεις διαφορές στον ρόλο των δεσμών υδρογόνου στις δύο πρωτεΐνες. Στη συνέχεια μελετάται η μηχανική απόκριση της ανθρώπινης τρίχας υπό εφελκυστική τάση με συνδυασμό φασματοσκοπίας Raman και οπτικής μικροσκοπίας (Κεφάλαιο 5), αναδεικνύοντας άμεση συσχέτιση μεταξύ μακροσκοπικής παραμόρφωσης και παραμόρφωσης των φολίδων (λεπιών) του περιτρίχιου (επιδερμίδας) (cuticle), μεταβολές στη διαμόρφωση δισουλφιδικών δεσμών και τον καθοριστικό ρόλο του κυτταρικού μεμβρανικού συμπλέγματος (cell membrane complex-CMC) στη διατήρηση της δομικής της ακεραιότητας. Μια ολοκληρωμένη πολυκλιμακική μελέτη της ανθρώπινης τρίχας (Κεφάλαιο 6), μέσω συνδυασμού μ-XRF, μ-XANES και SAXS, αποκαλύπτει ότι η νανοδομή των ενδιάμεσων ινιδίων συσχετίζεται άμεσα με το δεσμικό περιβάλλον του Zn και όχι με τη συνολική περιεκτικότητα σε S. Η προσέγγιση αυτή επεκτείνεται στη μελέτη ανθρώπινων νυχιών (Κεφάλαιο 7), όπου παρατηρούνται έντονες χημικές και δομικές ανομοιογένειες σε ψωριασικά και δυστροφικά δείγματα, περιλαμβάνοντας μεταβολές στον τρόπο σύνδεσης Zn και S (αναλογία και συμμετοχή των ομάδων κυστεϊνης), διεύρυνση του πλέγματος των ινιδίων και αυξημένη αταξία της πρωτεϊνικής μήτρας, προσφέροντας μια ενιαία ερμηνεία για τη μειωμένη μηχανική αντοχή τους. Συμπληρωματικές μελέτες ζωικών νυχιών (Κεφάλαιο 8) αναδεικνύουν διαφοροποιήσεις που σχετίζονται με το είδος. Συνολικά (Κεφάλαιο 9), η διατριβή καταδεικνύει ότι μεταβολές σε μοριακό επίπεδο, όπως η δέσμευση ιχνοστοιχείων και το τοπικό δεσμικό περιβάλλον του Zn, συνδέονται με την οργάνωση στη νανο- και μεσο-κλίμακα των κερατινωδών ιστών, υπογραμμίζοντας τη δυναμική των συνδυαστικών συμπληρωματικών τεχνικών στη μελέτη της δομής, της μηχανικής συμπεριφοράς και της παθολογίας βιολογικών υλικών.