Epigenetic regulation in rodent primordial germ cells and preimplantation embryos

Abstract

During the course of mammalian life the epigenome of each cell in the body responds to intra- and extracellular stimuli and it adapts and shapes its features (e.g. histone modifications, DNA methylation) accordingly. This is in contrast to the genome sequence, whichmostly remains constant throughout life and it is almost identical in every cell of the body. Nevertheless, the coordinated functions of the genome and the epigenome will guide the unique gene expression program of each cell type, which will eventually define its functional identity during development. In this thesis I focused on several major epigenetic reorganization events that take place during early preimplantation rodent (mouse and rat) development and also during the course of gametogenesis. One of the epigenetic changes that occur in the early life of the mouse concerns solely the female mouse preimplantation embryo and involves regulation of the activity of its two X chromosomes. Following fertilization, the presence of a single X chromosome in the male embryo and of two X chromosomes in the female embryo generates a X-linked gene dosage imbalance. To establish a balance between X and autosomal gene expression, and to compensate for the X-linked gene expression dosage difference between the sexes, the female embryo silences one of its two X chromosomes through a process known as X chromosome inactivation (XCI). In murine preimplantation stages, it is always the paternal X chromosome (Xp) that is silenced and therefore this is an imprinted XCI (iXCI) mechanism. XCI is initiated by Xist, a long non-coding RNA that is transcribed from the future inactive X chromosome and covers that chromosome in cis. Interestingly enough, iXCI is not conserved in all mammalian species. For example, in human preimplantation embryos XIST upregulation takes place at the blastocyst stage from both parental X chromosomes and X-linked dosage compensation between the two sexes is achieved by lowering expression levels of the X-linked genes in females from both X chromosomes at the same time, rather than shutting down completely one X chromosome. This finding indicates that iXCI may be a feature of the mouse preimplantation embryo solely and underscores the necessity of characterizing XCI in other rodent species. As the mouse embryo develops, iXCI is reversed in the inner cell mass (ICM) of the blastocyst around embryonic day 4.5 (E4.5). This X reactivation is then again followed by XCI at approximately E5.5 in the epiblast cells. This time though, XCI is random, meaning that both parental X chromosomes have equal chances to get inactivated. The epiblast cells will give rise to the embryo proper. Once one X chromosome gets silenced in an epiblast cell de novo, its silenced state will be clonally propagated in the subsequent divisions. At around E6.5 of mouse embryo development, the formation of the germline initiates in the dorsal epiblast through signalling emerging from the proximal extra-embryonic ectoderm. At this point the emerging primordial germ cells (PGCs) hold the same epigenetic signature and gene expression profile as the surrounding epiblast cells, which are destined to become somatic in nature. While developing further, genome wide reprogramming takes place in PGCs. This includes global alterations in histone modifications e.g. loss of H3K9me2, enrichment of H3K27me3 and global loss of DNA methylation, including also DNA methylation marking imprinted genes. All these alterations will lead to silencing of the somatic gene expression program, and to the activation of a germline one. However, during this reprogramming wave, the pericentromeres may need to retain their main epigenetic characteristics, especially since loss of histone modifications on these regions is linked to genetic aberrations. The inactive X chromosome does not escape from the genome wide epigenetic resetting in the germline and it is reactivated in the female PGCs. At around E13.5-E14.5, female PGCs enter meiosis, where both X chromosomes within the developing oocyte remain active. In addition, during oogenesis the X chromosome acquires an imprint, which will ensure that the maternal X chromosome will remain active during early mouse preimplantation development. In male E13.5-E14.5 embryos, the PGCs enter mitotic arrest. Mitosis is resumed shortly after birth and male germ cells initiate spermatogenesis. As in females, male germ cells also enter meiosis, where homologous chromosomes pair and exchange genetic information to eventually produce genetically unique haploid gametes. The pairing of the X and Y sex chromosomes is challenging since the sex chromosomes are highly non-homologous and only synapse in a small homologous region called pseudoautosomal region (PAR). The extensive asynapsis between the X and Y chromosomes is associated with their transcriptional inactivation in a process called Meiotic Sex Chromosome Inactivation (MSCI). This transcriptional inactivation largely persists (although some genes arereactivated) one stage later, in the haploid round spermatids and is now termed as Post-meiotic Sex Chromosome Repression (PSCR). Later on, during spermiogenesis, the vast majority of histones in the developing sperm is replaced by protamines, that will facilitatethe further compaction of the sperm genome into the small sperm nucleus. Following fertilization, the protamines are removed and replaced with unmodified histones provided by the oocyte. Current evidence suggests, that the Xp Xist gene becomes active at the 2-cell stage, concomitant with zygotic genome activation (ZGA). However, the possibility that certain epigenetic marks related to MSCI and PSCR persist on the sperm genome, and may have an impact on iXCI after fertilisation, cannot be excluded. All the above-mentioned reprogramming events must be tightly coordinated and controlled, since defects in the cascade of steps comprising these events is linked to embryonic lethality or infertility. In this thesis I have focused on characterising and understanding epigenetic phenomena taking place during early rodent preimplantation and PGC development. Therefore, in Chapter 1 I provide a detailed theoretical overview of the epigenetic phenomena examined in this thesis.In Chapter 2, we sought to examine the impact of the paternal epigenome on mouse iXCI. For this purpose, we made use of the round spermatid injection (ROSI) technology, and we injected round spermatids deficient for Xist (XpΔXist) and which already carry a largely transcriptionally inactive X chromosome (due to PSCR), enriched with silencing histone marks such as H3K9me3. We speculated that by bypassing the histone-to-protamine and protamine-to-histone transitions through ROSI and by injecting an alreadypre-inactivated Xp we might be able to establish Xp inactivation, in the absence of a functional paternal Xist. At the same time we hypothesized that we would rescue female embryonic lethality that is normally observed when sperm lacking functional Xist is used forfertilisation. Indeed, by performing ROSI with ΔXist round spermatids we were able to rescue the embryonic lethality of XpXistXm female embryos. Surprisingly though, RNA-DNA FISH experiments for the maternal wild type and the paternal mutated Xist gene and RNA revealed that the rescue was not mediated by an Xist independent inactivation of Xp, but rather by inactivating the maternal X chromosome (Xm) through maternally provided Xist mediated silencing. Initiation of Xm inactivation in XpΔXistΧm ROSI derived female embryos takes place later (~morula stage) compared to Xp inactivation in wild type embryos derived either by natural mating or by injecting wild type round spermatids (~4-cell stage), and silencing marks (H3K27me3) are established in the blastocyst rather than during the morula stage. We found that an XCI trans-activator named RNF12 is present in high levels in male and female embryos, when performing ROSI. However, since we never observed Xist expression in male embryos following ROSI, we speculate that additional still unknown factors act together with RNF12 to mediate to silencing of Xm, in the presence of XpΔXist. This then eventually allows survival of these female embryos. Interestingly, rescuing was not achieved when CAS/EiJ spermatids were used instead of C57BL6, indicating that critical factors contributing to the rescuing may not be (sufficiently) expressed in the CAS/EiJ round spermatids. Overall, our data suggest that the correct regulation of expression of X-linked trans-activators of XCI from possibly both X chromosomes is of critical importance in the establishment of XCI in mouse. Future experimentation may provide evidence on the identity of such XCI trans-activators. Going one step later in development, in Chapter 3 we focused on the epigenetic signature of pericentric heterochromatin during PGC development. In this study, we used different fixation and sample preparation methods to carefully examine the epigenetic state of pericentric heterochromatin during PGC development. Our results indicated that pericentric heterochromatin maintains its epigenetic marks throughout PGC development. However, we did notice that under a certain condition the original observations by others - that pericentric heterochromatin loses its epigenetic identity at E11.5 mouse embryo development - could also be reproduced. The data we obtained nicely illustrated the necessity of evaluating results of different experimental approaches in order to reach valid conclusions. In addition, analysis by immunofluorescence with specific markers of pericentromeric clustering (chromocenter formation) revealed that pericentromeres did not cluster together in a similar fashion as in the surrounding somatic cells, but they mainly remained as individual entities within the E10.5-E13.5 PGC nuclei. This individualisation was not accompanied by transcriptional activation of pericentric transcripts (major satellites), and might reflect alterations in the organisation and structure of PGC pericentromeres. Lastly, we observed higher accumulation of the chromatin remodeller ATRX on the pericentromeres of E11.5 PGCs compared to the surrounding soma of the same developmental stage. In the future it would be interesting to examine what is the exact function of the elevated ATRX accumulation in the pericentromeres of E11.5 PGCs, and when the dissociation of the chromocenters initiates in the germline. In Chapter 4 we established a robust in vitro differentiation strategy in order to examine XCI in rat differentiating stem cells (ESCs). Studying XCI in a species other than the mouse may provide valuable information about the conserved aspects of iXCI in rodents. This is particularly important, especially since iXCI does not seem to be conserved in all mammalian species e.g. human. With the use of our in vitro strategy, we were able to demonstrate that the process of XCI in the female rat cell lines initiates at ~ day 2 of differentiation by accumulation of Xist transcripts on one of the two X chromosomes. X-linked gene silencing through H3K27me3 enrichment on the same X chromosome also rapidly follows the Xist accumulation. Importantly, by overexpressing factors known to be decisive for XCI in mouse (REX1 and RNF12), in rESCs we observed that certain XCI regulation aspects (REX1-RNF12 axis) are indeed conserved between mouse and rat. In Chapter 5 we established a powerful and rapid DNA-RNA FISH protocol, which enables the simultaneous detection of DNA and RNA molecules in mouse pre-implantation embryos, without compromising the sample’s quality. This was achieved by incorporating and adapting steps used in DNA FISH such as sample incubation in HCl solution in our RNA FISH protocol common. The use of our DNA-RNA FISH protocol may be a valuable tool not only in basic science, for example when studying different XCI aspects in the early embryo, but also in diagnostics, since it could be potentially adapted and applied to any other type of material (e.g. cultured cells, patient tissue samples) where both nascent RNA transcripts (Xist or others) and genomic positions need to be detected.To conclude, in Chapter 6 I have discussed the results obtained during the course of my Ph.D. study in light of the current knowledge concerning the epigenetic phenomena presented and studied in this thesis. Finally, I provide suggestions for future research directions, in line with experimental restrictions but also possibilities when studying low abundance-cells, such as PGCs or early embryos, that will facilitate obtaining a better overview of the examined epigenetic phenomena described here.

Επιγενετική ρύθμιση σε αρχέγονα γεννητικά κύτταρα τρωκτικών και έμβρυα προ-εμφύτευσης Κατά τη διάρκεια της ζωής των θηλαστικών, το επιγονιδίωμα κάθε κυττάρου του σώματος ανταποκρίνεται σε ενδο- και εξωκυττάρια ερεθίσματα και προσαρμόζει και διαμορφώνει τα χαρακτηριστικά του (π.χ. τροποποιήσεις ιστονών, μεθυλίωση DNA) αντίστοιχα. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με την αλληλουχία του γονιδιώματος, η οποία παραμένει ως επί το πλείστον σταθερή καθ' όλη τη διάρκεια της ζωής και είναι σχεδόν πανομοιότυπη σε κάθε κύτταρο του σώματος. Ωστόσο, οι συντονισμένες λειτουργίες του γονιδιώματος και του επιγονιδιώματος θα καθοδηγήσουν το μοναδικό πρόγραμμα γονιδιακής έκφρασης κάθε κυτταρικού τύπου, το οποίο τελικά θα καθορίσει τη λειτουργική του ταυτότητα κατά την ανάπτυξη. Σε αυτή τη διατριβή εστίασα σε αρκετά σημαντικά γεγονότα επιγενετικής αναδιοργάνωσης που λαμβάνουν χώρα κατά την πρώιμη ανάπτυξη τρωκτικών (ποντικού και αρουραίου) πριν την εμφύτευση, καθώς και κατά τη διάρκεια της γαμετογένεσης. Μία από τις επιγενετικές αλλαγές που συμβαίνουν στην πρώιμη ζωή του ποντικού αφορά αποκλειστικά το θηλυκό έμβρυο προ-εμφύτευσης και περιλαμβάνει τη ρύθμιση της δραστηριότητας των δύο χρωμοσωμάτων Χ. Μετά τη γονιμοποίηση, η παρουσία ενός μόνο χρωμοσώματος Χ στο αρσενικό έμβρυο και δύο χρωμοσωμάτων Χ στο θηλυκό έμβρυο δημιουργεί μια ανισορροπία δοσολογίας γονιδίων συνδεδεμένων με το Χ. Για να εξισορροπηθεί η έκφραση μεταξύ γονιδίων του Χ και αυτοσωμικών γονιδίων, και για να αντισταθμιστεί η διαφορά δοσολογίας γονιδιακής έκφρασης συνδεδεμένης με το Χ μεταξύ των φύλων, το θηλυκό έμβρυο σιγεί ένα από τα δύο χρωμοσώματά του Χ μέσω μιας διαδικασίας γνωστής ως αδρανοποίηση του χρωμοσώματος Χ (XCI). Στα στάδια προ-εμφύτευσης του ποντικού, αδρανοποιείται πάντα το πατρικό χρωμόσωμα Χ (Xp) και επομένως πρόκειται για μηχανισμό αποτυπωμένης αδρανοποίησης (iXCI). Η XCI ξεκινά από το Xist, ένα μακρύ μη κωδικό RNA που μεταγράφεται από το μελλοντικά αδρανές χρωμόσωμα Χ και καλύπτει αυτό το χρωμόσωμα σε θέση cis.Αξιοσημείωτο είναι ότι η iXCI δεν είναι συντηρημένη σε όλα τα είδη θηλαστικών. Για παράδειγμα, στα ανθρώπινα έμβρυα προ-εμφύτευσης, η ενεργοποίηση του XIST λαμβάνει χώρα στο στάδιο της βλαστοκύστης και από τα δύο γονεϊκά χρωμοσώματα Χ, και η αντιστάθμιση δοσολογίας γονιδίων συνδεδεμένων με το Χ μεταξύ των δύο φύλων επιτυγχάνεται μειώνοντας τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων συνδεδεμένων με το Χ στα θηλυκά και από τα δύο χρωμοσώματα Χ ταυτόχρονα, αντί να απενεργοποιείται πλήρως ένα χρωμόσωμα Χ. Αυτό το εύρημα υποδεικνύει ότι η iXCI μπορεί να αποτελεί χαρακτηριστικό αποκλειστικά του εμβρύου ποντικού προ-εμφύτευσης και υπογραμμίζει την ανάγκη χαρακτηρισμού της XCI σε άλλα είδη τρωκτικών. Καθώς το έμβρυο του ποντικού αναπτύσσεται, η iXCI αντιστρέφεται στην εσωτερική κυτταρική μάζα (ICM) της βλαστοκύστης γύρω στην εμβρυϊκή ημέρα 4.5 (E4.5). Αυτή η επανενεργοποίηση του Χ ακολουθείται και πάλι από XCI περίπου στο E5.5 στα κύτταρα της επιβλάστης. Αυτή τη φορά όμως, η XCI είναι τυχαία, που σημαίνει ότι και τα δύο γονεϊκά χρωμοσώματα Χ έχουν ίσες πιθανότητες αδρανοποίησης. Τα κύτταρα της επιβλάστης θα δώσουν γένεση στο ίδιο το έμβρυο. Μόλις ένα χρωμόσωμα Χ σιγηθεί de novo σε ένα κύτταρο της επιβλάστης, η σιγημένη κατάστασή του θα διαδοθεί κλωνικά στις επόμενες διαιρέσεις. Γύρω στο E6.5 της ανάπτυξης του εμβρύου ποντικού, ο σχηματισμός της γαμετικής σειράς ξεκινά στη ραχιαία επιβλάστη μέσω σηματοδότησης που προέρχεται από το εγγύς εξωεμβρυϊκό εξώδερμα. Σε αυτό το σημείο, τα αναδυόμενα αρχέγονα γεννητικά κύτταρα (PGCs) φέρουν την ίδια επιγενετική υπογραφή και προφίλ γονιδιακής έκφρασης με τα περιβάλλοντα κύτταρα της επιβλάστης, τα οποία προορίζονται να γίνουν σωματικά. Καθώς αναπτύσσονται περαιτέρω, λαμβάνει χώρα επαναπρογραμματισμός σε ολόκληρο το γονιδίωμα στα PGCs. Αυτός περιλαμβάνει καθολικές αλλαγές στις τροποποιήσεις ιστονών, π.χ. απώλεια H3K9me2, εμπλουτισμό H3K27me3 και καθολική απώλεια μεθυλίωσης DNA, συμπεριλαμβανομένης και της μεθυλίωσης DNA που σημαδεύει αποτυπωμένα γονίδια. Όλες αυτές οι αλλαγές θα οδηγήσουν στη σίγηση του σωματικού προγράμματος γονιδιακής έκφρασης και στην ενεργοποίηση ενός προγράμματος γαμετικής σειράς. Ωστόσο, κατά τη διάρκεια αυτού του κύματος επαναπρογραμματισμού, τα περικεντρομερή μπορεί να χρειάζεται να διατηρήσουν τα κύρια επιγενετικά χαρακτηριστικά τους, ιδιαίτερα δεδομένου ότι η απώλεια τροποποιήσεων ιστονών σε αυτές τις περιοχές συνδέεται με γενετικές ανωμαλίες. Το αδρανές χρωμόσωμα Χ δεν εξαιρείται από τον επιγενετικό επαναπρογραμματισμό σε ολόκληρο το γονιδίωμα στη γαμετική σειρά και επανενεργοποιείται στα θηλυκά PGCs. Γύρω στο E13.5-E14.5, τα θηλυκά PGCs εισέρχονται στη μείωση, όπου και τα δύο χρωμοσώματα Χ εντός του αναπτυσσόμενου ωοκυττάρου παραμένουν ενεργά. Επιπλέον, κατά τη διάρκεια της ωογένεσης, το χρωμόσωμα Χ αποκτά ένα αποτύπωμα, το οποίο θα εξασφαλίσει ότι το μητρικό χρωμόσωμα Χ θα παραμείνει ενεργό κατά την πρώιμη ανάπτυξη του εμβρύου ποντικού προ-εμφύτευσης. Στα αρσενικά έμβρυα E13.5-E14.5, τα PGCs εισέρχονται σε μιτωτική αναστολή. Η μίτωση επαναλαμβάνεται λίγο μετά τη γέννηση και τα αρσενικά γεννητικά κύτταρα ξεκινούν τη σπερματογένεση. Όπως στα θηλυκά, τα αρσενικά γεννητικά κύτταρα εισέρχονται επίσης στη μείωση, όπου τα ομόλογα χρωμοσώματα ζευγαρώνουν και ανταλλάσσουν γενετική πληροφορία για να παράγουν τελικά γενετικά μοναδικούς απλοειδείς γαμέτες. Η σύζευξη των φυλετικών χρωμοσωμάτων Χ και Υ είναι δύσκολη, δεδομένου ότι τα φυλετικά χρωμοσώματα είναι σε μεγάλο βαθμό μη ομόλογα και συνάπτονται μόνο σε μια μικρή ομόλογη περιοχή που ονομάζεται ψευδοαυτοσωμική περιοχή (PAR). Η εκτεταμένη ασύναψη μεταξύ των χρωμοσωμάτων Χ και Υ συσχετίζεται με τη μεταγραφική τους αδρανοποίηση σε μια διαδικασία που ονομάζεται Μειωτική Αδρανοποίηση Φυλετικών Χρωμοσωμάτων (MSCI). Αυτή η μεταγραφική αδρανοποίηση παραμένει σε μεγάλο βαθμό (αν και ορισμένα γονίδια επανενεργοποιούνται) ένα στάδιο αργότερα, στις απλοειδείς στρογγυλές σπερματίδες, και τώρα ονομάζεται Μετα-μειωτική Καταστολή Φυλετικών Χρωμοσωμάτων (PSCR). Αργότερα, κατά τη σπερμιογένεση, η συντριπτική πλειονότητα των ιστονών στο αναπτυσσόμενο σπέρμα αντικαθίσταται από πρωταμίνες, που θα διευκολύνουν την περαιτέρω συμπύκνωση του γονιδιώματος του σπέρματος στον μικρό πυρήνα του. Μετά τη γονιμοποίηση, οι πρωταμίνες αφαιρούνται και αντικαθίστανται με μη τροποποιημένες ιστόνες που παρέχονται από το ωοκύτταρο. Τα σημερινά δεδομένα υποδηλώνουν ότι το γονίδιο Xist του πατρικού Χ ενεργοποιείται στο στάδιο των 2 κυττάρων, ταυτόχρονα με τη ζυγωτική ενεργοποίηση γονιδιώματος (ZGA). Ωστόσο, δεν μπορεί να αποκλειστεί η πιθανότητα ότι ορισμένα επιγενετικά σήματα σχετιζόμενα με τη MSCI και την PSCR παραμένουν στο γονιδίωμα του σπέρματος και μπορεί να έχουν αντίκτυπο στην iXCI μετά τη γονιμοποίηση. Όλα τα παραπάνω γεγονότα επαναπρογραμματισμού πρέπει να είναι αυστηρά συντονισμένα και ελεγχόμενα, δεδομένου ότι ελαττώματα στην αλυσίδα βημάτων που αποτελούν αυτά τα γεγονότα συνδέονται με εμβρυϊκή θνησιμότητα ή υπογονιμότητα. Σε αυτή τη διατριβή εστίασα στον χαρακτηρισμό και την κατανόηση επιγενετικών φαινομένων που λαμβάνουν χώρα κατά την πρώιμη ανάπτυξη τρωκτικών προ-εμφύτευσης και την ανάπτυξη PGCs. Ως εκ τούτου, στο **Κεφάλαιο 1** παρέχω μια λεπτομερή θεωρητική επισκόπηση των επιγενετικών φαινομένων που εξετάζονται σε αυτή τη διατριβή.Στο **Κεφάλαιο 2**, επιδιώξαμε να εξετάσουμε τον αντίκτυπο του πατρικού επιγονιδιώματος στην αποτυπωμένη αδρανοποίηση του Χ (iXCI) στον ποντικό. Για τον σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε την τεχνολογία ένεσης στρογγυλών σπερματίδων (ROSI) και ενέσαμε στρογγυλές σπερματίδες ελλειμματικές για το Xist (XpΔXist), που ήδη φέρουν ένα σε μεγάλο βαθμό μεταγραφικά αδρανές χρωμόσωμα Χ (λόγω PSCR), εμπλουτισμένο με σιγητικά σήματα ιστονών όπως η H3K9me3. Υποθέσαμε ότι παρακάμπτοντας τις μεταβάσεις ιστόνης-σε-πρωταμίνη και πρωταμίνης-σε-ιστόνη μέσω ROSI και ενέχοντας ένα ήδη προ-αδρανοποιημένο Xp, θα μπορούσαμε να εδραιώσουμε αδρανοποίηση του Xp απουσία λειτουργικού πατρικού Xist. Ταυτόχρονα, υποθέσαμε ότι θα σώζαμε τη θηλυκή εμβρυϊκή θνησιμότητα που κανονικά παρατηρείται όταν χρησιμοποιείται σπέρμα χωρίς λειτουργικό Xist για γονιμοποίηση. Πράγματι, εκτελώντας ROSI με ΔXist στρογγυλές σπερματίδες καταφέραμε να σώσουμε την εμβρυϊκή θνησιμότητα των XpΔXistXm θηλυκών εμβρύων. Εκπληκτικά όμως, πειράματα RNA-DNA FISH για το μητρικό αγρίου τύπου και το πατρικό μεταλλαγμένο γονίδιο Xist και RNA αποκάλυψαν ότι η διάσωση δεν μεσολαβήθηκε από ανεξάρτητη του Xist αδρανοποίηση του Xp, αλλά μάλλον από αδρανοποίηση του μητρικού χρωμοσώματος Χ (Xm) μέσω μητρικά παρεχόμενης σίγησης μέσω Xist. Η έναρξη της αδρανοποίησης του Xm σε θηλυκά έμβρυα προερχόμενα από ROSI με XpΔXist λαμβάνει χώρα αργότερα (~στάδιο μόρουλας) σε σύγκριση με την αδρανοποίηση του Xp σε έμβρυα αγρίου τύπου (~στάδιο 4 κυττάρων), και τα σήματα σίγησης (H3K27me3) εδραιώνονται στη βλαστοκύστη αντί στο στάδιο της μόρουλας. Βρήκαμε ότι ένας trans-ενεργοποιητής XCI με το όνομα RNF12 βρίσκεται σε υψηλά επίπεδα σε αρσενικά και θηλυκά έμβρυα κατά τη διενέργεια ROSI. Ωστόσο, δεδομένου ότι δεν παρατηρήσαμε ποτέ έκφραση Xist σε αρσενικά έμβρυα μετά από ROSI, υποθέτουμε ότι επιπρόσθετοι, ακόμα άγνωστοι παράγοντες δρουν μαζί με τον RNF12 για να μεσολαβήσουν στη σίγηση του Xm, παρουσία XpΔXist. Αυτό τελικά επιτρέπει την επιβίωση αυτών των θηλυκών εμβρύων. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η διάσωση δεν επιτεύχθηκε όταν χρησιμοποιήθηκαν σπερματίδες CAS/EiJ αντί για C57BL6, υποδεικνύοντας ότι κρίσιμοι παράγοντες που συμβάλλουν στη διάσωση μπορεί να μην εκφράζονται (επαρκώς) στις στρογγυλές σπερματίδες CAS/EiJ. Συνολικά, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η σωστή ρύθμιση της έκφρασης trans-ενεργοποιητών XCI συνδεδεμένων με το Χ, πιθανώς και από τα δύο χρωμοσώματα Χ, είναι κρίσιμης σημασίας για την εδραίωση της XCI στον ποντικό. Προχωρώντας ένα βήμα αργότερα στην ανάπτυξη, στο **Κεφάλαιο 3** εστιάσαμε στην επιγενετική υπογραφή της περικεντρικής ετεροχρωματίνης κατά την ανάπτυξη PGC. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε διαφορετικές μεθόδους μονιμοποίησης και προετοιμασίας δειγμάτων για να εξετάσουμε προσεκτικά την επιγενετική κατάσταση της περικεντρικής ετεροχρωματίνης κατά την ανάπτυξη PGC. Τα αποτελέσματά μας υπέδειξαν ότι η περικεντρική ετεροχρωματίνη διατηρεί τα επιγενετικά σήματά της καθ' όλη τη διάρκεια της ανάπτυξης PGC. Ωστόσο, παρατηρήσαμε ότι υπό μια συγκεκριμένη συνθήκη, οι αρχικές παρατηρήσεις άλλων ερευνητών — ότι η περικεντρική ετεροχρωματίνη χάνει την επιγενετική ταυτότητά της στο E11.5 — μπορούσαν επίσης να αναπαραχθούν. Τα δεδομένα που αποκτήσαμε απεικόνισαν με σαφήνεια την αναγκαιότητα αξιολόγησης αποτελεσμάτων διαφορετικών πειραματικών προσεγγίσεων προκειμένου να εξαχθούν έγκυρα συμπεράσματα. Επιπλέον, ανάλυση με ανοσοφθορισμό με ειδικούς δείκτες περικεντρομερικής ομαδοποίησης (σχηματισμός χρωμοκέντρων) αποκάλυψε ότι τα περικεντρομερή δεν ομαδοποιούνταν με παρόμοιο τρόπο όπως στα περιβάλλοντα σωματικά κύτταρα, αλλά παρέμεναν κυρίως ως μεμονωμένες οντότητες εντός των πυρήνων PGC στα E10.5-E13.5. Αυτή η εξατομίκευση δεν συνοδευόταν από μεταγραφική ενεργοποίηση περικεντρικών μεταγράφων (κύριοι δορυφόροι) και μπορεί να αντικατοπτρίζει αλλαγές στην οργάνωση και τη δομή των περικεντρομερών στα PGCs. Τέλος, παρατηρήσαμε μεγαλύτερη συσσώρευση του αναδιαμορφωτή χρωματίνης ATRX στα περικεντρομερή των E11.5 PGCs σε σύγκριση με τα περιβάλλοντα σωματικά κύτταρα του ίδιου αναπτυξιακού σταδίου. Στο **Κεφάλαιο 4** εδραιώσαμε μια ισχυρή στρατηγική in vitro διαφοροποίησης προκειμένου να εξετάσουμε την XCI σε διαφοροποιούμενα βλαστοκύτταρα (ESCs) αρουραίου. Η μελέτη της XCI σε ένα είδος εκτός του ποντικού μπορεί να παρέχει πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με τις συντηρημένες πτυχές της iXCI στα τρωκτικά. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό, ειδικά δεδομένου ότι η iXCI δεν φαίνεται να είναι συντηρημένη σε όλα τα είδη θηλαστικών, π.χ. στον άνθρωπο. Με τη χρήση της in vitro στρατηγικής μας, μπορέσαμε να αποδείξουμε ότι η διαδικασία XCI στις θηλυκές κυτταρικές σειρές αρουραίου ξεκινά περίπου την ημέρα 2 της διαφοροποίησης με τη συσσώρευση μεταγράφων Xist σε ένα από τα δύο χρωμοσώματα Χ. Η σίγηση γονιδίων συνδεδεμένων με το Χ μέσω εμπλουτισμού H3K27me3 στο ίδιο χρωμόσωμα Χ ακολουθεί επίσης ταχέως τη συσσώρευση Xist. Σημαντικό είναι ότι, υπερεκφράζοντας παράγοντες γνωστούς ως καθοριστικούς για την XCI στον ποντικό (REX1 και RNF12) σε ESCs αρουραίου, παρατηρήσαμε ότι ορισμένες ρυθμιστικές πτυχές της XCI (άξονας REX1-RNF12) είναι πράγματι συντηρημένες μεταξύ ποντικού και αρουραίου. Στο **Κεφάλαιο 5** εδραιώσαμε ένα ισχυρό και ταχύ πρωτόκολλο DNA-RNA FISH, το οποίο επιτρέπει την ταυτόχρονη ανίχνευση μορίων DNA και RNA σε έμβρυα ποντικού προ-εμφύτευσης, χωρίς να θίγεται η ποιότητα του δείγματος. Αυτό επιτεύχθηκε ενσωματώνοντας και προσαρμόζοντας βήματα που χρησιμοποιούνται στο DNA FISH, όπως η επώαση δείγματος σε διάλυμα HCl, στο κοινό μας πρωτόκολλο RNA FISH. Η χρήση του πρωτοκόλλου DNA-RNA FISH μας μπορεί να αποτελέσει ένα πολύτιμο εργαλείο όχι μόνο στη βασική επιστήμη, για παράδειγμα κατά τη μελέτη διαφορετικών πτυχών της XCI στο πρώιμο έμβρυο, αλλά και στη διαγνωστική, καθώς θα μπορούσε να προσαρμοστεί και να εφαρμοστεί σε οποιοδήποτε άλλο είδος υλικού (π.χ. καλλιεργούμενα κύτταρα, δείγματα ιστών ασθενών) όπου χρειάζεται ανίχνευση τόσο νεοσυντιθέμενων μεταγράφων RNA (Xist ή άλλων) όσο και γονιδιωματικών θέσεων. Συμπερασματικά, στο **Κεφάλαιο 6** συζήτησα τα αποτελέσματα που αποκτήθηκαν κατά τη διάρκεια της διδακτορικής μου μελέτης υπό το πρίσμα των τρεχουσών γνώσεων σχετικά με τα επιγενετικά φαινόμενα που παρουσιάστηκαν και μελετήθηκαν σε αυτή τη διατριβή. Τέλος, παρέχω προτάσεις για μελλοντικές ερευνητικές κατευθύνσεις, σε συμφωνία με τους πειραματικούς περιορισμούς αλλά και τις δυνατότητες κατά τη μελέτη κυττάρων χαμηλής αφθονίας, όπως τα PGCs ή τα πρώιμα έμβρυα, που θα διευκολύνουν τη απόκτηση μιας καλύτερης εικόνας των εξεταζόμενων επιγενετικών φαινομένων που περιγράφονται εδώ.