Characterization of intracellular and extracellular double-stranded RNAs from Multiple Sclerosis patients' biofluids and their association with viral infection and inflammatory pathways΄

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is a chronic demyelinating disease of the central nervous system (CNS) with a multifactorial etiology involving genetic predisposition, immune dysregulation, and environmental triggers, among which Epstein–Barr virus (EBV) infection plays a pivotal role. Although a causal link between EBV and MS has been established, the molecular mechanisms connecting EBV reactivation to inflammation and disease onset remain unclear.This study investigates double-stranded RNA (dsRNA) as a key molecular intermediate linking viral infection, EBV reactivation, and MS pathogenesis. A biobank of treatment-naïve Greek MS patients was established, including paired plasma and cerebrospinal fluid (CSF) samples. Flow-cytometric analysis revealed an immunological signature of EBV reactivation, characterized by reduced circulating CD19⁺ B cells, increased CD56^dim NK cells in blood, and their absence in CSF, suggesting immune compartmentalization of EBV-infected B cells.Two sensitive ELISAs were developed for dsRNA quantification and anti-dsRNA antibody detection. MS patients displayed significantly elevated plasma dsRNA levels correlating with inflammatory cytokines (IP-10, IL-8, IFN-λ1), particularly in those with atypical EBV-R (anti-EBNA1 IgM⁺/IgG⁺). dsRNA levels were highest in patients with concurrent SARS-CoV-2 infection, and antibody titers revealed a positive correlation between EBV and SARS-CoV-2 IgM, indicating cross-activation of antiviral immunity. To validate these findings, J2-dsRIP-seq was applied to PBMCs, confirming enrichment of SARS-CoV-2-derived dsRNA (mainly ORF1ab) and structured endogenous transcripts (lncRNAs, pseudogenes, snoRNAs) containing GC-rich palindromic motifs within repetitive elements (Alu, LINE-1).Collectively, these results identify dsRNA as a novel biomarker of viral activity and support a model in which EBV acts as a “sleeping giant” that can be reawakened by stressors such as SARS-CoV-2 infection, thereby triggering immune dysregulation and MS onset.

Η πολλαπλή σκλήρυνση (ΠΣ) αποτελεί μια χρόνια απομυελινωτική νόσο του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ), με πολυπαραγοντική αιτιολογία που περιλαμβάνει γενετική προδιάθεση, απορύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος και περιβαλλοντικούς παράγοντες, μεταξύ των οποίων η λοίμωξη από τον ιό Epstein–Barr (EBV) κατέχει πρωταγωνιστικό ρόλο. Πρόσφατες μελέτες απέδειξαν αιτιώδη σχέση μεταξύ EBV και ΠΣ, χωρίς ωστόσο να είναι πλήρως κατανοητοί οι μοριακοί μηχανισμοί που συνδέουν την επανενεργοποίηση του ιού με τη φλεγμονή και την έναρξη της νόσου. Η παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνά τα δίκλωνη RNA (double-stranded RNA, dsRNA) ως κεντρικό μοριακό δείκτη που συνδέει τη ιογενή λοίμωξη με την ενεργοποίηση του EBV και την παθογένεση της ΠΣ. Για τον σκοπό αυτό δημιουργήθηκε μια βιοτράπεζα από Έλληνες ασθενείς με ΠΣ, η οποία περιλάμβανε ταυτόχρονα δείγματα πλάσματος και εγκεφαλονωτιαίου υγρού (ΕΝΥ) από ασθενείς που δεν είχαν λάβει προηγουμένως ανοσοτροποποιητική θεραπεία και υγιείς μάρτυρες. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε κυτταρομετρία ροής και βρέθηκε ότι οι ασθενείς με ενδείξεις επανενεργοποίησης του EBV (EBV-R) παρουσιάζουν χαρακτηριστικές ανοσολογικές μεταβολές: μείωση των κυκλοφορούντων CD19⁺ Β λεμφοκυττάρων στο πλάσμα, αύξηση των κυτταροτοξικών CD56dim NK κυττάρων στο πλάσμα και απουσία κυτταροτοξικών CD56dim NK κυττάρων στο ΕΝΥ. Τα κυτταροτοξικά CD56dim NK κύτταρα υπό φυσιολογικές συνθήκες σκοτώνουν κύτταρα μολυσμένα από ιούς, όπως για παράδειγμα τα Β κύτταρα που έχουν μολυνθεί από EBV. Αυτό υποδηλώνει ότι τα Β κύτταρα μπορεί να κρύβονται σε διαμερίσματα όπως το ΕΝΥ, όπου δεν στοχεύονται από τα κυτταροτοξικά CD56dim NK κύτταρα. Παράλληλα, για τη διερεύνηση των dsRNAs αναπτύχθηκε και βελτιστοποιήθηκε μία ευαίσθητη μέθοδος sandwich ELISA, βασισμένη στα μονοκλωνικά αντισώματα J2 και K2, για την ποσοτική ανίχνευση συνολικών επιπέδων dsRNA σε βιολογικά υγρά, καθώς και μια δεύτερη ELISA για την ανίχνευση αντισωμάτων (IgM, IgG, IgA) έναντι dsRNA χρησιμοποιώντας ως αντιγόνο το συνθετικό dsRNA Poly(I:C). Με τις παραπάνω τεχνικές βρήκαμε ότι οι ασθενείς με ΠΣ εμφανίζουν σημαντικά αυξημένα επίπεδα dsRNA στο πλάσμα κατά το πρώτο κλινικό επεισόδιο, τα οποία συσχετίζονται θετικά με φλεγμονώδεις κυτταροκίνες (μεταξύ των οποίων IP-10, IL-8, IFN-λ1). Επιπλέον, οι ασθενείς με άτυπη επανενεργοποίηση EBV (θετικοί για anti-EBNA1 IgM και IgG αντισώματα) παρουσίαζαν τα υψηλότερα επίπεδα dsRNA και κυτταροκινών στο πλάσμα. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στην αλληλεπίδραση μεταξύ λοίμωξης SARS-CoV-2 και EBV-R, καθώς και στη συμβολή της στην πυροδότηση της ΠΣ. Οι ασθενείς με πρόσφατη λοίμωξη ή εμβολιασμό για SARS-CoV-2 παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα dsRNA και αντι-ιικών κυτταροκινών, ενώ όλοι οι ασθενείς με άτυπη EBV-R ήταν ταυτόχρονα θετικοί για SARS-CoV-2. Οι τίτλοι IgM του EBV (έναντι του EBNA1 και του VCA) συσχετίστηκαν θετικά με τους τίτλους IgM SARS-CoV-2 (έναντι της Nucleocapsid και της Spike), γεγονός που υποδηλώνει διασταυρούμενη ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού. Επιβεβαιωτικά δεδομένα από ανεξάρτητη ομάδα ασθενών με COVID-19 έδειξαν ότι τα επίπεδα dsRNA συσχετίζονται αποκλειστικά με τα επίπεδα αντισωμάτων IgM κατά του δίκλωνου RNA και όχι με IgG ή IgA αντισώματα, υποδεικνύοντας ότι η παρουσία dsRNA αντικατοπτρίζει πρώιμη ιική ενεργοποίηση. Για επιβεβαίωση των ευρημάτων μας, σχεδιάσαμε και εφαρμόσαμε J2-dsRIP-seq σε RNA που απομονώθηκε από PBMCs από ασθενείς με πρόσφατη λοίμωξη από κορονοϊό και δείξαμε ότι η μέθοδος εμπλουτίζει ιικά dsRNAs, με κυρίαρχα ευρήματα από το γονιδιακό τμήμα ORF1ab του SARS-CoV-2. Πέρα από τα ιικά, χαρτογραφήσαμε πολλά ενδογενή dsRNAs, κυρίως lncRNAs, ψευδογονίδια και sno/snRNAs, με χαρακτηριστικά GC-πλούσια παλίνδρομα μοτίβα που εντοπίζονται συχνά σε επαναλαμβανόμενα στοιχεία (Alu/SINE, LINE-1), με αυξημένη πυκνότητα στο Χ χρωμόσωμα. Οι ασθενείς με άτυπη EBV-R (n = 9) είχαν αυξημένα μονοπάτια φλεγμονής και απάντησης σε ιούς σε σύγκριση με τους οροθετικούς (n = 3). Συνολικά, η μελέτη αυτή αναδεικνύει το dsRNA ως νέο βιοδείκτη για παρουσία ιικής λοίμωξης και υποστηρίζει ότι ο EBV είναι σαν ένας μεγάλος γίγαντας που κοιμάται, αλλά μπορεί να ξυπνήσει κάτω από συγκεκριμένες καταστάσεις στρες, όπως για παράδειγμα εξαιτίας μίας άλλης ιογενούς λοίμωξης (SARS-CoV-2), και να οδηγήσει στην εκδήλωση ΠΣ.