Ανίχνευση των αδενοϊών με μοριακές και ανοσοενζυμικές μεθόδους σε δείγματα ομφαλοπλακουντιακών μοσχευμάτων και διερεύνηση της κάθετης μετάδοσής τους

Abstract

ABSTRACT Objective: Human Adenovirus (HAdV) is a prevalent pathogen with high seropositive among children. Transmission of HAdV may occur both vertically and horizontally. The HAdV entry into the cells takes place by attachment to CAR receptor (coxsackievirus and adenovirus receptor) of trophoblast cells, leading to transplacental passage of adenovirus, and latent embryos infection. Viral acquisition from the mother may occur via the genital tract. HAdV genome was detected in 20.5% of the full-term placenta according to international literature. Molecular studies revealed that adenovirus serotypes 19 and 37 have tropism for the genital tract. Umbilical cord blood (UCB) units represent an alternative source of progenitor stem cells in allogenic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Adenovirus associated with high mortality rates in HSCT recipients. The purpose of this study is to examine the presence of HAdV in UCBs, and study their vertical transmission through umbilical cord. Materials/Methods: A total number of 98 UCB plasma samples were assayed using the real time PCR technology. Plasma samples (n=50) from cryopreserved cord blood units with their maternal samples (n=50) were tested. Informed consent was signed by the parents for research use. Molecular detection of HAdV was performed by Real-Time PCR using the Altona RealStar@ Adenovirus PCR Kit (Altona, Hamburg, Germany) on Rotor-Gene_Q_cycler. Results: There were 3 positive sample (3.06 %) in 98 plasma samples UCBs analyzed for HAdV. Diagnostic tests for the prevalent pathogen were performed showing 67.3% of the samples were CMV IgG positive (previews infection) and 4.2% were CMV IgM positive (new infection). One HAdV(+) sample was also CMV IgG(+)/IgM(+), while the other two were CMV IgG(+)/IgM(-) and CMV IgG(-)/IgM(-) without reaching a statistically significant correlation (p value 0.11). All the samples were negative for HTLV_I-II, HCV, HBsAg and HIV_I-II. Among the 50 UCBs originally tested and their maternal samples, 3 units were positive for HAdV. Viral loads was measured 0.41x106, 8.75x106 and 9.84x106 DNA copies/μl in UCB plasma and 0.79x106, 4.51x106 and 30.9 x106 DNA copies/μl in their maternal plasma, retrospectively. Conclusions: Our data align with international literature and indirectly indicate the ventrical transmission of HAdV through umbilical cord. Additionally, the molecular control of HAdV in UCBs provide a sensitive method which may reduce the infection rate and improve the safety of transplantation. In our study, we compared the positive HAdV UCB samples with the positive IgM samples (recent or active infection) without reaching a statistically significant correlation (p value 0.11).

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στόχος: Ο ανθρώπινος αδενοϊός (HAdV) είναι ένα παθογόνο με υψηλή οροθετικότητα στα παιδιά. Η μετάδοση του HAdV μπορεί να συμβεί τόσο κάθετα όσο και οριζόντια. Η είσοδος του HAdV στα κύτταρα λαμβάνει χώρα μέσω προσκόλλησης στον υποδοχέα CAR (coxsackievirus and adenovirus receptor). Η παρουσία του υποδοχέα CAR στα τροφοβλαστικά κύτταρα, οδηγεί σε διαπλακουντιακή διέλευση του αδενοϊού και σε λανθάνουσα μόλυνση των εμβρύων. Η απόκτηση του ιού από τη μητέρα μπορεί να συμβεί και μέσω της γεννητικής οδού. Το γονιδίωμα του HAdV ανιχνεύθηκε στο 20.5% του πλακούντα τελειόμηνων νεογνών σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία. Μοριακές μελέτες αποκάλυψαν ότι οι ορότυποι 19 και 37 του αδενοϊού έχουν τροπισμό για την γεννητική οδό. Οι μονάδες ομφαλοπλακουντιακού αίματος (UCB) αντιπροσωπεύουν μια εναλλακτική πηγή προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων για την αλλογενή μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (HSCT). Ο αδενοϊός σχετίζεται με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας σε λήπτες HSCT. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να εξεταστεί η παρουσία του HAdV στα UCBs, και να προσδιοριστεί το ιϊκό τους φορτίο και να μελετηθεί η κάθετη μετάδοσή του μέσω του ομφάλιου λώρου. Υλικά/Μέθοδοι: Συνολικά 98 δείγματα πλάσματος UCB αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την τεχνολογία της ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου. Παράλληλα εξετάστηκαν τα δείγματα πλάσματος (n=50) από κρυοσυντηρημένες μονάδες ομφάλιου αίματος, που έφεραν αντίστοιχα μητρικά δείγματα, με τα μητρικά τους δείγματα (n=50). Υπήρχε έγγραφη συγκατάθεση από τους γονείς για ερευνητική χρήση. Η απομόνωση γενετικού υλικού από το πλάσμα πραγματοποιήθηκε με το κιτ, extraction kit QIAamp DNA Blood, QIAGEN και η μοριακή ανίχνευση του HAdV πραγματοποιήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιώντας το κιτ Altona RealStar@ Adenovirus PCR (Altona, Αμβούργο, Γερμανία) σε Rotor-Gene_Q_cycler. Αποτελέσματα: Ανιχνεύθηκαν 3 θετικά δείγματα (3.06%) σε 98 δείγματα πλάσματος UCB που αναλύθηκαν για HAdV. Από τον έλεγχο των ανοσοσφαρινών του CMV, το 67.3% των δειγμάτων ήταν θετικά για IgG CMV (παρελθούσα λοίμωξης) και το 4.2% ήταν θετικά για IgM CMV (ενεργός λοίμωξη). Ένα δείγμα HAdV(+) ήταν επίσης CMV IgG(+)/IgM(+) ενώ τα δύο άλλα CMV IgG(+)/IgM(-) και CMV IgG(-)/IgM(-) χωρίς να επιτευχθεί στατιστικά σημαντική συσχέτιση (p value 0.11). Όλα τα δείγματα ήταν αρνητικά για HTLV_I-II, HCV, HBsAg και HIV_I-II. Μεταξύ των 50 UCBs που εξετάστηκαν αρχικά με τα αντίστοιχα 50 δείγματα των μητέρων, 3 μονάδες ήταν θετικές για HAdV. Τα ιικά φορτία μετρήθηκαν, σύμφωνα με τον τύπο του κατασκευαστή της PCR, σε 0.41x106, 8.75x106 και 9.84x106 αντίγραφα DNA/μl στο πλάσμα UCB και 0.79x106, 4.51x106 και 30.9x106 αντίγραφα DNA/μl στο μητρικό πλάσμα. Συμπεράσματα: Τα δεδομένα μας ευθυγραμμίζονται με τη διεθνή βιβλιογραφία και υποδεικνύουν έμμεσα την κάθετη μετάδοση του HAdV μέσω του ομφάλιου λώρου και δείχνουν ότι ο HAdV θα πρέπει να εξετάζεται σε ομφαλοπλακουντιακά μοσχεύματα σε προ- μεταμοσχευτικό στάδιο, προκειμένου να αποφευχθεί η μετάδοση του ιού μέσω αυτών κατά τη διαδικασία της μεταμόσχευσης, αποφεύγοντας δυσμενείς εκβάσεις. Το ποσοστό του HAdV είναι 3.06% όλων των δειγμάτων. Επιπλέον, ο μοριακός έλεγχος του HAdV σε UCBs παρέχει μια ευαίσθητη μέθοδο που μπορεί να μειώσει το ποσοστό μόλυνσης και να βελτιώσει την ασφάλεια της μεταμόσχευσης. Τέλος, τα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η παρουσία αδενοϊού δεν σχετίζεται με ενεργό λοίμωξη CMV, στην παρούσα μελέτη.