Investigation of microbial communities during implementation of engineering approaches for the reduction of excess sludge produced in wastewater treatment plants

Abstract

This study delves into innovative approaches for sludge minimization and treatment in wastewater management, with a focus on the application of chemical uncouplers and ozonation within membrane bioreactor (MBR) systems. Chemical uncouplers, such as 3-chlorophenol, 4-nitrophenol etc., have been shown to effectively reduce excess sludge production by disrupting oxidative phosphorylation, decoupling energy generation from microbial biomass synthesis. This biochemical interference not only lowers sludge yield but also influences microbial metabolic pathways, promoting selective microbial adaptation and shifts in community structure. High-throughput sequencing analysis of 16S rRNA genes revealed dynamic changes in bacterial populations following chemical uncoupler application, with significant impacts on sludge-associated microbial diversity and metabolic activity. Ozonation, a complementary chemical method, involves the application of ozone to the mixed liquor, leading to the oxidative breakdown of complex and refractory organic compounds. This process not only enhances sludge biodegradability, leading to excess sludge reduction, but also contributes to microbial community restructuring by selectively suppressing certain bacterial taxa while promoting the growth of ozonation-tolerant genera. Microbial assays demonstrated that ozonation reduced extracellular polymeric substances (EPS) and soluble microbial products (SMP), key contributors to biofilm formation and membrane fouling. The combination of ozonation with MBR technology demonstrated a superior treatment efficiency by maintaining high effluent quality, while minimizing excess biosolids production and microbial fouling. The integration of these bioengineering approaches with MBR configurations addresses key operational challenges, including membrane biofouling. Physicochemical monitoring played a pivotal role in evaluating MBR system stability and performance. Assessments of dissolved oxygen (DO), chemical oxygen demand (COD), total Kjeldahl nitrogen (TKN), and pH on a frequent basis were conducted to optimize operational parameters. Furthermore, monitoring EPS and SMP concentrations provided critical insights into membrane fouling dynamics and microbial metabolic responses. By optimizing solids retention time (SRT) and maintaining controlled DO levels, performance of MBR system regarding nutrients removal, biofouling prevention and excess sludge production, were maximized. The decline in transmembrane pressure (TMP) following ozonation highlighted a reduction in membrane fouling. Furthermore, solids retention time (SRT) optimization enhanced the synergistic effects of chemical interventions. A drastic decline in biosolids concentration from 6500 mg/L and 5650 mg/L prior to pNP and mCP addition, to 4070 mg/L and 3540 mg/L was observed immediately after the addition of these metabolic uncouplers, which, however, restored to the initial values within a period of 10-12 days, possibly employed selective resistance (and/or degradation mechanisms in the case of pNP) to tolerate pNP and mCP presence. The adaptive recovery suggests that the sludge microbiota exhibits resilience to metabolic uncoupler’s exposure, demonstrating the ability to restore biomass productivity following a brief period of inhibition. pNP addition did not affect COD removal efficiency (an average COD removal efficiency of 98% prior and after pNP addition), although addition of mCP resulted in a substantial increase in both influent and effluent concentration, due to the more recalcitrant nature of this molecule, which appeared to remain undegradable compared to pNP. However, an average of 672 mg/L and 669 mg/L as well as 847 mg/L and 642 mg/L COD prior to and after uncouplers addition were removed in the cases of pNP and mCP respectively, indicating that wastewater COD removal (excluding the added mCP) was not affected by the addition of the uncoupler. In the case of pNP, TKN and NH₄⁺-N removal efficiencies decreased significantly immediately after uncoupler addition, although in a reversible manner, since nitrifiers restored their ammonia oxidation activity one week after pNP application. Regarding mCP addition, a more pronounced inhibition of nitrifying activity was denoted, but in a reversible manner after a more prolonged period of time. Regarding pNP, an initial decline in proteinaceous SMP and EPS concentrations was observed, which gradually stabilized, indicating microbial stress followed by adaptation. In comparison, mCP produced an even more pronounced effect on SMP and EPS, particularly in proteinaceous compounds. Microbial community structure revealed substantial taxonomic shifts in response to pNP and mCP addition, though these shifts varied significantly in terms of extent and microbial groups affected. For pNP, alterations were observed primarily in the relative abundance of Bacteroidota (syn. Bacteroidetes), Gammaproteobacteria and Bacillota (syn. Firmicutes). Notably, nitrifying bacteria sustained their relative abundance, even as their activity was temporarily suppressed. Beta-diversity estimation indicated a significant change in community structure after pNP addition, suggesting community response effect to pNP-induced stress. Bacterial genera involved in nitrophenol degradation, such as Clostridium, Cytophaga and Pseudomonas, were proliferated after pNP addition. In comparison, mCP addition led to more substantial shifts in microbial diversity and structure, as evidenced by a significant decline in diversity indices. A pronounced inhibition of the nitrifiers occurred. Notably, Nitrosomonas and Nitrospira were absent after mCP addition, indicating that mCP imposed severe inhibition on these bacterial taxa. mCP addition favored mCP-resistant genera, like Pseudomonas and Arcanobacterium, highlighting the selective pressure applied on activated sludge microbiota by mCP, promoting the survival and dominance of more resistant to chlorophenols, taxa. Ozonation led to the oxidative breakdown of recalcitrant organic matter, enhancing sludge biodegradability and nutrient transformation. Results demonstrated a 38% reduction in extracellular polymeric substances (EPS) and a 32% decrease in soluble microbial products (SMP), key contributors to biofilm formation and membrane fouling. The combination of ozonation and MBR technology improved system efficiency, achieving chemical oxygen demand (COD) and total Kjeldahl nitrogen (TKN) removal rates consistently above 95%. Ozonation of activated sludge and its return in the MBR into batches permitted the decline of mixed liquor solids from a peak value of 9.8 g/L prior to the addition, to an average biosolids concentration of 5.5 ± 0.2 g/L after ozonated sludge addition, sustaining a stable biosolids concentration for a prolonged time period. Regarding ozonated sludge addition, Pseudomonadota and Bacteroidota were the predominant phyla in the MBR, followed by Planctomycetota, Actinomycetota and Chloroflexota. Lewinella and Methylophilus were predominant prior to the ozonated sludge addition, however, after addition, within Bacteroidota, a significant shift was observed, with Aureliella, Flavobacterium and Chryseosolibacter becoming more prominent, replacing Lewinella. Beta-diversity analysis revealed a substantial shift in bacterial community structure, which stabilized within 10 days after the addition of ozonated sludge in batches. Notably, nitrifying communities remained unaffected, suggesting that they are tolerant to moderate ozone concentrations. These findings underscore the transformative potential of chemical uncouplers and ozonation of excess sludge and its addition in batches in advancing MBR technology. The combined bioprocessing and microbial insights contributed to achieving enhanced treatment efficiency, reduced biosolids production and improved MBR system stability, paving the way for more sustainable and cost-effective wastewater treatment solutions.

Η παρούσα έρευνα εξετάζει καινοτόμες προσεγγίσεις για την ελαχιστοποίηση της περίσσειας ιλύος, με έμφαση στην εφαρμογή χημικών αποσυζευκτών και οζόνωσης σε συστήματα βιοαντιδραστήρων μεμβρανών (MBR). Οι χημικοί αποσυζευκτές, όπως η 3-χλωροφαινόλη (m-chlorophenol - mCP), η 4-νιτροφαινόλη (p-nitrophenol - pNP) κ.ά., έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν αποτελεσματικά την περίσσεια ιλύος επηρεάζοντας την οξειδωτική φωσφορυλίωση, αποσυνδέοντας την παραγωγή ενέργειας από τη σύνθεση μικροβιακής βιομάζας. Αυτή η βιοχημική παρέμβαση όχι μόνο μειώνει την απόδοση της ενεργού ιλύος που παράγεται, αλλά επηρεάζει επίσης τα μικροβιακά μεταβολικά μονοπάτια, οδηγώντας στη προσαρμογή εξειδικευμένων μικροβιακών ομάδων και εντέλει σε αλλαγή της δομής της μικροβιακής κοινότητας. Η αλληλούχηση υψηλής απόδοσης γονιδίων 16S rRNA αποκάλυψε δυναμικές αλλαγές στον πληθυσμό βακτηρίων κατά την εφαρμογή των εξεταζόμενων χημικών αποσυζευκτών, επάγοντας σημαντικές επιπτώσεις στη μικροβιακή ποικιλότητα και στη μεταβολική δραστηριότητα της ιλύος. Η οζόνωση, μια συμπληρωματική χημική μέθοδος επεξεργασίας σε μονάδες επεξεργασίας υγρών αποβλήτων, περιλαμβάνει την εφαρμογή όζοντος στο μικτό υγρό, οδηγώντας στην οξειδωτική διάσπαση σύνθετων οργανικών ενώσεων. Η διαδικασία αυτή όχι μόνο ενισχύει τη βιοαποδομησιμότητα της ιλύος, οδηγώντας σε υψηλή μείωση της παραγόμενης ιλύος, αλλά συμβάλλει επίσης σε αλλαγή της δομής της μικροβιακής κοινότητας αναστέλλοντας επιλεκτικά ορισμένες ταξινομικές ομάδες βακτηρίων, ενώ προωθεί την ενίσχυση γενών ανθεκτικών στην οζόνωση. Μικροβιακές αναλύσεις έδειξαν ότι η προσθήκη οζονισμένης ιλύος μείωσε τις εξωκυτταρικές πολυμερείς ουσίες (Extracellular Polymeric Substances - EPS) και τα διαλυτά μικροβιακά προϊόντα (Soluble Microbial Products - SMP), που συμβάλλουν στο σχηματισμό βιοϋμενίου και στην έμφραξη της μεμβράνης. Ο συνδυασμός της οζόνωσης με την τεχνολογία MBR οδήγησε σε καλύτερη απόδοση επεξεργασίας διατηρώντας υψηλή ποιότητα εκροής, ενώ ελαχιστοποίησε την παραγόμενη περίσσεια βιοστερεών και τη μικροβιακή έμφραξη της μεμβράνης. Η υιοθέτηση αυτών των προσεγγίσεων βιοχημικής μηχανικής στην τεχνολογία MBR μπορεί να αντιμετωπίσει βασικές λειτουργικές προκλήσεις, όπως η έμφραξη των μεμβρανών των συστημάτων αυτών. Η παρακολούθηση των φυσικοχημικών παραμέτρων έπαιξε σημαντικό ρόλο στην αξιολόγηση της σταθερότητας και της απόδοσης του συστήματος MBR. Πραγματοποιήθηκε παρακολούθηση σε σταθερή βάση του διαλυμένου οξυγόνου (Dissolved Oxygen - DO), του χημικά απαιτούμενου οξυγόνου (Chemical Oxygen Demand - COD), του ολικού κατά Kjeldahl αζώτου (Total Kjeldahl Nitrogen - TKN) και του pH για τη βελτιστοποίηση των λειτουργικών παραμέτρων. Επιπλέον, η παρακολούθηση των συγκεντρώσεων EPS και SMP παρείχε χρήσιμες πληροφορίες για τυχόν έμφραξη της μεμβράνης και τη μεταβολική απόκριση του μικροβιακού πληθυσμού. Με τη βελτιστοποίηση της ηλικίας ιλύος (Sludge Retention Time - SRT) και τη εφαρμογή ελεγχόμενων επιπέδων διαλυμένου οξυγόνου, μεγιστοποιήθηκαν οι επιδόσεις του συστήματος MBR όσον αφορά την απομάκρυνση θρεπτικών ουσιών, την πρόληψη της βιολογικής έμφραξης της μεμβράνης και τη μείωση της παραγόμενης περίσσειας ιλύος. Η μείωση της διαμεμβρανικής πίεσης (Transmembrane Pressure - TMP) μετά την προσθήκη οζονισμένης ιλύος ανέδειξε τη θετική επίδραση της οξειδωτικής αυτής μεθόδου στην αντιμετώπιση της έμφραξης της μεμβράνης. Επιπλέον, η βελτιστοποίηση της ηλικίας ιλύος ενίσχυσε συνεργιστικά την αποτελεσματικότητα των εφαρμοζόμενων χημικών μεθόδων. Παρατηρήθηκε δραστική μείωση της συγκέντρωσης των βιοστερεών από 6500 mg/L και 5650 mg/L πριν από την προσθήκη pNP και mCP, σε 4070 mg/L και 3540 mg/L αμέσως μετά την προσθήκη αυτών των μεταβολικών αποσυζευκτών, η οποία συγκέντρωση βιοστερεών, ωστόσο, επανήλθε στις αρχικές τιμές μέσα σε διάστημα 10-12 ημερών, ενδεχομένως μέσω επιλεκτικής ανθεκτικότητας (ή/και μηχανισμούς αποδόμησης στην περίπτωση του pNP) ως τρόποι προσαρμογής στην παρουσία pNP και mCP. Η προσαρμογή αυτή υποδηλώνει ότι οι μικροβιακές κοινότητες της ιλύος προσαρμόστηκαν και εμφάνισαν ανθεκτικότητα κατά την έκθεση σε αυτούς τους μεταβολικούς αποσυζευκτές, παρατηρώντας ανάκαμψη στη σύνθεση της βιομάζας μετά από μια σύντομη περίοδο αναστολής. Η προσθήκη pNP δεν επηρέασε την απόδοση απομάκρυνσης COD (μέση απόδοση απομάκρυνσης COD ίση με 98% πριν και μετά την προσθήκη pNP), αν και η προσθήκη mCP οδήγησε σε σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης COD τόσο στην εισροή όσο και στην εκροή του συστήματος, λόγω της πιο ανθεκτικής δομής αυτού του μορίου, το οποίο φαίνεται να ανθίσταται στη μικροβιακή διάσπαση σε σύγκριση με την pNP. Ωστόσο, κατά μέσο όρο 672 mg/L και 669 mg/L, καθώς και 847 mg/L και 642 mg/L COD πριν και μετά την προσθήκη αποζευκτή απομακρύνθηκαν στις περιπτώσεις της προσθήκης pNP και mCP αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι η απομάκρυνση του COD του υπό επεξεργασία υγρού αποβλήτου (εξαιρουμένου του προστιθέμενου mCP) δεν επηρεάστηκε από την προσθήκη του αποζευκτή. Στην περίπτωση της pNP, η αποτελεσματικότητα απομάκρυνσης TKN και NH₄⁺-N μειώθηκε σημαντικά αμέσως μετά την προσθήκη του αποσυζευκτή, αν και με αντιστρεπτό τρόπο, καθώς οι νιτροποιητές αποκατέστησαν τη δραστηριότητα οξείδωσης της αμμωνίας μία εβδομάδα μετά την εφαρμογή της pNP. Όσον αφορά την προσθήκη mCP, σημειώθηκε εντονότερη αναστολή της νιτροποιητικής δραστηριότητας, αλλά επίσης με αντιστρεπτό τρόπο, μετά όμως από πιο παρατεταμένο χρονικό διάστημα. Όσον αφορά την προσθήκη pNP, παρατηρήθηκε μια αρχική μείωση των συγκεντρώσεων των πρωτεϊνικών SMP και EPS, η οποία σταδιακά σταθεροποιήθηκε, υποδεικνύοντας μικροβιακή διαταραχή που ακολουθήθηκε από προσαρμογή. Συγκριτικά, η προσθήκη mCP οδήγησε σε ακόμη πιο έντονη επίδραση στα εκλυόμενα SMP και EPS, ιδίως εκείνων πρωτεϊνικής φύσεως. Η προσθήκη pNP και mCP οδήγησε σε σημαντικές μεταβολές στη δομή των μικροβιακών κοινοτήτων, αν και αυτές διέφεραν σημαντικά ως προς την έκταση και τις μικροβιακές ομάδες που επηρεάστηκαν. Για την pNP, παρατηρήθηκαν μεταβολές κυρίως στη σχετική αφθονία των Bacteroidota (συν. Bacteroidetes), των Gammaproteobacteria και των Bacillota (συν. Firmicutes). Ειδικότερα, τα νιτροποιητικά βακτήρια διατήρησαν τη σχετική αφθονία τους, ακόμη και όταν η δραστηριότητά τους αναστάλθηκε προσωρινά. Η εκτίμηση της β-ποικιλότητας έδειξε σημαντική αλλαγή στη δομή της κοινότητας βακτηρίων μετά την προσθήκη pNP, γεγονός που αποδίδεται στην παροδική αναστολή που προκάλεσε η προσθήκη pNP. Γένη βακτηρίων που συμμετέχουν στην αποδόμηση της νιτροφαινόλης, όπως μέλη των γενών Clostridium, Cytophaga και Pseudomonas, ενισχύθηκαν μετά την προσθήκη pNP. Συγκριτικά, η προσθήκη mCP οδήγησε σε πιο έντονες αλλαγές στη μικροβιακή ποικιλότητα και δομή, όπως αποδεικνύεται από τη σημαντική μείωση των δεικτών βιοποικιλότητας. Επίσης, σημειώθηκε εντονότερη αναστολή των νιτροποιητών. Ειδικότερα, δεν ανιχνεύθηκαν μέλη των γενών Nitrosomonas και Nitrospira μετά την προσθήκη mCP, υποδεικνύοντας ότι η mCP προκάλεσε σοβαρή αναστολή στις ταξινομικές αυτές ομάδες βακτηρίων. Η προσθήκη mCP ευνόησε τα ανθεκτικά σε αυτήν γένη, όπως είναι μέλη των γενών Pseudomonas και Arcanobacterium, αναδεικνύοντας την επιλεκτική πίεση που ασκείται στις μικροβιακές κοινότητες της ενεργού ιλύος από την mCP, οδηγώντας στην επιβίωση και κυριαρχία των πιο ανθεκτικών στις χλωροφαινόλες, ταξινομικών ομάδων. Η οζόνωση οδήγησε στην οξειδωτική διάσπαση ανθεκτικών συστατικών της οργανικής ύλης, ενισχύοντας τη βιοαποδομησιμότητα της ιλύος και τη διάσπαση θρεπτικών συστατικών. Τα αποτελέσματα έδειξαν μείωση κατά 38% των εξωκυτταρικών πολυμερών ουσιών (EPS) και μείωση κατά 32% των διαλυτών μικροβιακών προϊόντων (SMP), βασικών παραγόντων που συμβάλλουν στο σχηματισμό βιοϋμενίου και στην έμφραξη της μεμβράνης. Ο συνδυασμός της οζόνωσης και της τεχνολογίας MBR βελτίωσε την απόδοση του συστήματος, επιτυγχάνοντας ποσοστά απομάκρυνσης COD και TKN άνω του 95%. Η οζόνωση της περίσσειας ιλύος και η επιστροφή της στον MBR τμηματικά επέτρεψε τη μείωση των βιοστερεών του μεικτού υγρού από μια μέγιστη τιμή 9,8 g/L πριν από την προσθήκη, σε μια μέση συγκέντρωση βιοστερεών 5,5 ± 0,2 g/L μετά την προσθήκη οζονισμένης ιλύος, διατηρώντας μια σταθερή συγκέντρωση βιοστερεών για παρατεταμένη χρονική περίοδο. Όσον αφορά την προσθήκη οζονισμένης ιλύος, τα κυρίαρχα φύλα στον MBR ήταν τα Pseudomonadota και Bacteroidota, ακολουθούμενα από τα Planctomycetota, Actinomycetota και Chloroflexota. Τα γένη Lewinella και Methylophilus ήταν κυρίαρχα πριν από την προσθήκη οζονισμένης ιλύος, ωστόσο, μετά την προσθήκη, εντός του φύλου Bacteroidota, παρατηρήθηκε σημαντική διαδοχή, με τα Aureliella, Flavobacterium και Chryseosolibacter να γίνονται κυρίαρχα, σε σχέση με τα Lewinella. Η ανάλυση β-ποικιλότητας αποκάλυψε μια σημαντική μετατόπιση στη δομή της κοινότητας βακτηρίων, η οποία σταθεροποιήθηκε εντός 10 ημερών μετά την τμηματική προσθήκη οζονισμένης ιλύος. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι νιτροποιητικές κοινότητες παρέμειναν ανεπηρέαστες, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι ανθεκτικές σε μέτριες συγκεντρώσεις όζοντος. Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν τη δυνατότητα εφαρμογής χημικών αποσυζευκτών και τμηματικής προσθήκης οζονισμένης ιλύος για την προώθηση της τεχνολογίας MBR. Ο έλεγχος της βιοεπεξεργασίας σε συνδυασμό με τις γνώσεις που αποκτήθηκαν για τις μικροβιακές κοινότητες κατά την εφαρμογή των παραπάνω μεθόδων ελέγχου της περίσσειας ιλύος συνέβαλαν στην επίτευξη βελτιωμένης απόδοσης επεξεργασίας, μειωμένης παραγωγής βιοστερεών και βελτιωμένης σταθερότητας του συστήματος MBR, ανοίγοντας το δρόμο για πιο βιώσιμες και οικονομικά αποδοτικές λύσεις επεξεργασίας υγρών αποβλήτων.