Application of indigenous Rhodobacteraceae probiotic strains and microbiota characterization in the rearing of greater amberjack (Seriola dumerili) larvae

Abstract

This study aimed to isolate putative indigenous antagonistic bacteria from the greater amberjack (Seriola dumerili) rearing system—including larvae, live feed, rearing water, and tank wall biofilm—and evaluate their impact on the microbial assemblage within the rearing environment (larvae, water, and biofilm). Two main experiments were carried out at a commercial marine hatchery. In the first experiment, four 3.000 L cylindroconical tanks were each stocked with approximately 150.000 greater amberjack larvae. From 3 to 17 days after hatching (dah), larvae in two of the tanks received a combination of copepod (Acartia tonsa) nauplii and rotifers (Brachionus sp.), referred to as the "Copepods group." The remaining two tanks, the Control group, were fed rotifers only during the same period. All tanks followed a common feeding protocol that included rotifers (3–27 dah), Artemia nauplii (10–23 dah), enriched Artemia metanauplii (17–the end of the trial), and a formulated diet (23–the end of the trial).Larval samples were collected at 9, 16, 23, and 31 DAH for the isolation and identification of antagonistic bacterial strains. Additional samples were taken from the live feed, rearing water, and tank wall biofilm. Bacterial strains were isolated primarily from greater amberjack larvae and Artemia and identified via 16S rRNA gene sequencing. These strains belonged to Vibrionaceae, Pseudoalteromonadaceae, Alteromonadaceae, and Rhodobacteraceae. All isolates were screened in vitro for antagonistic activity based on their ability to inhibit the growth of marine fish pathogenic bacteria (three Vibrio strains and one Aeromonas strain). Several Vibrionaceae isolates demonstrated inhibitory effects, suggesting intra-genus competition. Additionally, strains from the Rhodobacteraceae family—Phaeobacter sp., Phaeobacter gallaeciensis JL 2886, and Ruegeria sp. InS-296—isolated from greater amberjack larvae, also exhibited antagonistic activity. This inhibition is attributed to the production of tropodithietic acid (TDA), a well-known antimicrobial secondary metabolite with physiological role which inhibits Vibrio growth. Also, in an in vivo preliminary test the three indigenous probiotic strains improved the hatching rate of Pagrus major eggs and enhanced the survival of newly hatched larvae, indicating their non-pathogenic nature. These findings highlight the larval microbiota of greater amberjack as a promising source of putative probiotic candidates. The host-associated microbiota of these larvae—whether fed with copepods in addition to conventional live feed or not—was characterized and found to be more strongly influenced by age rather than diet. Rhodobacteraceae was the dominant bacterial family across all larval samples, followed by Vibrionaceae. In the control group, the relative abundance of Vibrionaceae increased over time, while Rhodobacteraceae declined. In contrast, larvae fed with copepods showed an age-related increase in Rhodobacteraceae, reaching 69% at 31 days after hatching, while Vibrionaceae remained consistently low. These findings suggest that copepod supplementation may positively influence the composition of the larval microbiota. The second greater amberjack larval rearing experiment was conducted under the same conditions and rearing parameters as the first. In this experiment, the indigenous putative probiotic bacteria (Phaeobacter sp., Phaeobacter gallaeciensis JL 2886, and Ruegeria sp. InS-296) were immobilized on ceramic cylinders and used as biofilters in the water of two rearing tanks—"Probiotics group”. Two additional tanks, which did not receive probiotics, served as the "Control group." Both groups followed the same feeding protocol, which included rotifers, Artemia, and dry feed. The impact of probiotics on the microbial assemblage of the greater amberjack rearing system (larvae, tank water, and biofilm) was assessed. Sample type and time were the main factors shaping microbial communities, with probiotics having a limited effect on microbial richness. Probiotics significantly influenced the larvae's microbiota only at 23 dah, while both probiotics and time had a significant effect on the microbiota of all sample types. Seven core bacterial families were shared across all sample types: Vibrionaceae, Rhodobacteraceae, Pseudoalteromonadaceae, Nitrincolaceae, Alteromonadaceae, Saprospiraceae, and Flavobacteraceae, though their relative abundances varied by sample. Key unique taxa included NS10 marine group (in water), Saprospiraceae (in biofilm), and Cutibacterium (in larvae). Vibrionaceae increased in water as larvae began feeding on live feed. Dominant families were Vibrionaceae in larvae, Rhodobacteraceae in water, and both in biofilm. Ruegeria, notably, became more abundant in larvae from 23 dah. Overall, while indigenous probiotics influence microbial dynamics in the rearing of greater amberjack larvae to some extent, practical zootechnical and managerial issues must be resolved before using indigenous probiotics as biofilters at a commercial scale.

Η παρούσα μελέτη είχε στόχο την απομόνωση αυτόχθονων, δυνητικά ανταγωνιστικών βακτηρίων από το σύστημα εκτροφής ιχθυονυμφών μαγιάτικου (Seriola dumerili)—συμπεριλαμβανομένων των ιχθυονυμφών, της ζωντανής τροφής, του νερού εκτροφής και του βιοϋμενίου των τοιχωμάτων των δεξαμενών—και την αξιολόγηση της επίδρασής τους στο μικροβιακό σύνολο του περιβάλλοντος εκτροφής (ιχθυονύμφες, νερό και βιοϋμένιο). Διεξήχθησαν δύο κύρια πειράματα σε βιομηχανικής κλίμακας ιχθυογεννητικό σταθμό. Στο πρώτο πείραμα, τέσσερις κυλινδροκωνικές δεξαμενές 3.000 λίτρων εφοδιάστηκαν με περίπου 150.000 ιχθυονύμφες μαγιάτικου η καθεμία. Από την 3η έως την 17η ημέρα μετά την εκκόλαψη (dah), οι ιχθυονύμφες σε δύο από τις δεξαμενές τράφηκαν με συνδυασμό ναυπλίων κωπηποδών (Acartia tonsa) και τροχοζών (Brachionus sp.), ομάδα που ονομάστηκε «ομάδα Κωπηπόδων». Οι υπόλοιπες δύο δεξαμενές, η Ομάδα Ελέγχου, τράφηκαν μόνο με τροχόζωα την ίδια περίοδο. Όλες οι δεξαμενές ακολούθησαν κοινό διατροφικό πρωτόκολλο που περιελάμβανε: τροχόζωα (3–27 dah), ναύπλιους Artemia (10–23 dah), εμπλουτισμένους μεταναύπλιους Artemia (17–τέλος δοκιμής), και ξηρή τροφή (23–τέλος). Δείγματα ιχθυονυμφών συλλέχθηκαν τις ημέρες 9, 16, 23 και 31 μετά την εκκόλαψη για απομόνωση και ταυτοποίηση ανταγωνιστικών βακτηρίων. Πρόσθετα δείγματα συλλέχθηκαν από τη ζωντανή τροφή, το νερό και το βιοϋμένιο. Τα βακτήρια απομονώθηκαν κυρίως από ιχθυονύμφες και Artemia και ταυτοποιήθηκαν μέσω αλληλούχησης του γονιδίου 16S rRNA. Ανήκαν στις οικογένειες: Vibrionaceae, Pseudoalteromonadaceae, Alteromonadaceae και Rhodobacteraceae. Όλα τα απομονωμένα στελέχη εξετάστηκαν in vitro ως προς την ανταγωνιστική τους δράση, με βάση την ικανότητά τους να αναστέλλουν την ανάπτυξη παθογόνων θαλάσσιων βακτηρίων (τρία στελέχη Vibrio και ένα Aeromonas). Πολλά στελέχη Vibrionaceae έδειξαν ανασταλτική δράση, υποδεικνύοντας ανταγωνισμό εντός του γένους. Επιπλέον, στελέχη της οικογένειας Rhodobacteraceae—Phaeobacter sp., Phaeobacter gallaeciensis JL 2886 και Ruegeria sp. InS-296—που απομονώθηκαν από ιχθυονύμφες μαγιάτικου, επέδειξαν επίσης ανταγωνιστική δράση. Η δράση τους αποδίδεται στην παραγωγή του τροποδιθειϊκού οξέος (TDA), ενός δευτερογενούς μεταβολίτη με αντιμικροβιακές ιδιότητες που αναστέλλει την ανάπτυξη των Vibrio. Σε προκαταρκτικό in vivo πείραμα, τα τρία αυτά αυτόχθονα προβιοτικά βελτίωσαν το ποσοστό εκκολαψιμότητας γονιμοποιημένων αυγών του ιχθύος Pagrus major και ενίσχυσαν την επιβίωση των νεοεκκολαπτόμενων ιχθυονυμφών, καταδεικνύοντας ότι δεν είναι παθογόνα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το μικροβίωμα των προνυμφών μαγιάτικου αποτελεί πολλά υποσχόμενη πηγή αυτόχθονων προβιοτικών. Η σύνθεση του μικροβιώματος των ιχθυονυμφών, είτε τράφηκαν με κωπήποδα είτε όχι, επηρεάστηκε περισσότερο από την ηλικία και όχι από τη διατροφή. Η οικογένεια Rhodobacteraceae ήταν κυρίαρχη σε όλα τα δείγματα, ακολουθούμενη από την οικογένεια των Vibrionaceae. Στην ομάδα ελέγχου, η σχετική αφθονία των Vibrionaceae αυξανόταν με την ηλικία, ενώ των Rhodobacteraceae μειωνόταν. Αντίθετα, στις ιχθυονύμφες που τράφηκαν με κωπήποδα παρατηρήθηκε αύξηση των Rhodobacteraceae, φτάνοντας σε σχετική αφθονία 69% την 31η ημέρα, ενώ τα Vibrionaceae παρέμειναν χαμηλά. Το δεύτερο πείραμα διεξήχθη υπό τις ίδιες συνθήκες. Σε αυτό, τα αυτόχθονα προβιοτικά στελέχη (Phaeobacter sp., P. gallaeciensis JL 2886, Ruegeria sp. InS-296) ακινητοποιήθηκαν σε κεραμικούς κυλίνδρους και χρησιμοποιήθηκαν ως βιοφίλτρα στο νερό δύο δεξαμενών (Ομάδα Προβιοτικών). Οι άλλες δύο δεξαμενές αποτέλεσαν την Ομάδα Ελέγχου. Όλες οι δεξαμενές ακολούθησαν το ίδιο διατροφικό πρωτόκολλο. Η επίδραση των προβιοτικών στις βακτηριακές κοινότητες (ιχθυονύμφες, νερό, βιοϋμένιο) αξιολογήθηκε. Οι κύριοι παράγοντες διαμόρφωσης του μικροβιώματος του συστήματος εκτροφής ήταν ο τύπος δείγματος και ο χρόνος. Τα προβιοτικά είχαν επίδραση μόνο στη βακτηριακή αφθονία, επηρεάζοντας σημαντικά το μικροβίωμα των προνυμφών μόνο την 23η ημέρα. Οι σημαντικότερες οικογένειες που απαντήθηκαν σε όλα τα δείγματα ήταν: Vibrionaceae, Rhodobacteraceae, Pseudoalteromonadaceae, Nitrincolaceae, Alteromonadaceae, Saprospiraceae και Flavobacteraceae, με διαφορετική σχετική αφθονία σε κάθε τύπο δείγματος. Μοναδικά μικροβιακά είδη που ξεχώρισαν ήταν τα, NS10 marine group (στο νερό), Saprospiraceae (στο βιοϋμένιο) και Cutibacterium (στις ιχθυονύμφες). Η οικογένεια των Vibrionaceae αυξήθηκε στο νερό καθώς ξεκίνησε η σίτιση των ιχθυονυμφών με ζωντανή τροφή. Κυρίαρχες οικογένειες ανεδείχθησαν οι, Vibrionaceae στις ιχθυονύμφες, Rhodobacteraceae στο νερό και οι δύο στο βιοϋμένιο. Αν και τα αυτόχθονα προβιοτικά δεν επηρέασαν σημαντικά τη σύνθεση του συστήματος εκτροφής ιχθυονυμφών μαγιάτικου, πρακτικά και διαχειριστικά μέτρα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη για την εφαρμογή τους και την αποτελεσματικότητά τους ως βιοφίλτρα σε εμπορική κλίμακα.