Διερεύνηση των μηχανισμών ευαισθησίας / αντοχής στους αναστολείς πρωτεασώματος των μυελωματικών κυττάρων ασθενών με πολλαπλούν μυέλωμα

Abstract

Multiple Myeloma (MS) accounts for 10% of all the hematological neoplasms and is characterized by the abnormal proliferation and maturation of plasma cells in the bone marrow, leading more commonly to osteolytic bone lesions, hypercalcemia, renal failure and anemia. and less frequently to various other clinical manifestations. Despite recent advances in the treatment of myeloma with proteosome inhibitors (PIs), immunomodulatory drugs, monoclonal antibodies and other classes of agents, many patients ultimately develop resistance to treatment, resulting in relapse, which shares poor clinical course and dismal prognosis. The mechanisms underlying PIs’ resistance are not fully understood, while data suggest the development of complex interactions between the cell's proteolytic systems and oxidative stress. To this end, the dynamic relationship between the ubiquitin-proteasome system (UPS), autophagy, and oxidative stress in MM progression and PI resistance was investigated. Bone marrow samples from MM patients at various time points of disease course (baseline, remission, and relapse) and from control subjects, without bone marrow infiltration by any type of neoplastic cells were analyzed. The proteolytic activity of the proteasome, expression levels of the β5 proteasomal e subunit (PSMB5), autophagy marker LC3II, and intracellular reactive oxygen species expression levels (ROS) were assessed, using a combination of biochemical assays, Western blotting, and flow cytometry. Additionally, in vitro experiments were conducted, using cell lines to further elucidate the mechanisms of interaction between these systems. The results show that PSMB5 accumulation was significantly reduced after PI treatment, with a similar pattern observed in proteasome proteolytic activity (PPA). Conversely, LC3II protein levels were significantly elevated, at both, remission and relapse phase, compared to baseline levels, indicating enhanced autophagy activation, following PI treatment. A statistically significant negative correlation between PSMB5 and LC3II expression was identified across all disease phases, suggesting a reciprocal association between these two major cellular proteolytic systems. Median ROS levels were significantly higher at relapse, compared to both, baseline and remission levels, and were negatively correlated with PPA, and positively with autophagy activation. Longitudinal analysis of same patients’ samples demonstrated that changes in PSMB5 and LC3II levels exhibited an inverse association during disease progression and treatment, further supporting the compensatory relationship between the UPS and autophagy. In vitro experiments confirmed these findings, with autophagy inhibition using Wortmannin significantly inducing PSMB5 expression. Furthermore, the study identified PSMB5 expression levels as a promising prognostic marker of relapse, after treatment with PIs and suggests that the activation of autophagy serves as an adaptive/counteracting mechanism, contributing to PIs resistance. These findings may have important clinical implications, indicating that combined therapeutic approaches, targeting both proteolytic pathways may overcome resistance and improve treatment outcomes in MM patients. Furthermore, integrating the assessment of PSMB5, autophagy markers, and oxidative stress parameters into patient evaluation could provide valuable tools for predicting treatment response and optimizing personalized therapeutic strategies in MM

Το Πολλαπλό Μυέλωμα (ΠM) αποτελεί το 10% των αιματολογικών νεοπλασμάτων και χαρακτηρίζεται από τον διαταραγμένο πολλαπλασιασμό και ωρίμανση των πλασματοκυττάρων στο μυελό των οστών, οδηγώντας πιο συχνά σε οστικές αλλοιώσεις, υπερασβεστιαιμία, νεφρική ανεπάρκεια και αναιμία και σπανιότερα σε πλήθος άλλες κλινικές εκδηλώσεις. Παρά την πρόοδο στη θεραπεία του μυελώματος με αναστολείς πρωτεασώματος (PIs), ανοσοτροποποιητικά φάρμακα, μονοκλωνικά αντισώματα και άλλες κατηγορίες φαρμάκων, πολλοί ασθενείς τελικά αναπτύσσουν αντίσταση στη θεραπεία, με αποτέλεσμα την υποτροπή της νόσου, η οποία συνοδεύεται από κακή κλινική πορεία και δυσμενή πρόγνωση. Οι μηχανισμοί που διέπουν αυτή την αντίσταση στους PIs δεν είναι πλήρως κατανοητοί, ενώ τα δεδομένα υποδηλώνουν ην ανάπτυξη πολύπλοκων αλληλεπίδρασεων μεταξύ των πρωτεολυτικών συστημάτων του κυττάρου και του οξειδωτικού στρες. Για το σκοπό αυτό, διερευνήθηκε η σχέση μεταξύ του συστήματος ουβικουιτίνης-πρωτεασώματος (UPS), της αυτοφαγίας και του οξειδωτικού στρες στην εξέλιξη του ΠΜ και της αντοχής στους αναστολείς πρωτεασώματος. Αναλύθηκαν δείγματα μυελού των οστών από ασθενείς με ΠΜ σε διάφορα χρονικά σημεία της νόσου (αρχική διάγνωση, ύφεση και υποτροπή) και σε δείγματα ελέγχου από μη μυελωματικούς μάρτυρες. Η πρωτεολυτική δραστικότητα του πρωτεασώματος, τα επίπεδα έκφρασης της υπομονάδας πρωτεασώματος β5 (PSMB5), ο δείκτης αυτοφαγίας LC3II και τα επίπεδα του οξειδωτικού στρες ποσοτικοποιούμενα με την έκφραση των ROS, αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό βιοχημικών αναλύσεων, ανοσοαποτύπωσης Western και κυτταρομετρίας ροής. Επιπλέον, διεξήχθησαν πειράματα in vitro χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές για την περαιτέρω αποσαφήνιση των μηχανισμών αλληλεπίδρασης μεταξύ αυτών των συστημάτων. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενδοκυττάρια συγκέντρωση της PSMB5 μειώθηκε σημαντικά μετά τη θεραπεία με αναστολείς πρωτεασώματος, ενώ παρόμοιο μοτίβο παρατηρήθηκε στην πρωτεολυτική δραστικότητα του πρωτεασώματος (PPA). Αντίθετα, τα επίπεδα της πρωτεΐνης LC3II ήταν σημαντικά αυξημένα τόσο στη φάση ύφεσης όσο και σε εκείνη της υποτροπής, σε σύγκριση με την αρχική διάγνωση, υποδηλώνοντας αντιρροπιστική αύξηση της αυτοφαγίας μετά από θεραπεία με PI. Παράλληλα, σε όλα τα στάδια της νόσου εντοπίστηκε μια στατιστικά σημαντική αρνητική σχέση μεταξύ της έκφρασης PSMB5 και LC3II. Τα επίπεδα ROS βρέθηκαν σημαντικά υψηλότερα κατά την υποτροπή, σε σύγκριση τόσο με την αρχική διάγνωση όσο και με την ύφεση. Η ανάλυση δειγμάτων ίδιων ασθενών σε διαφορετικά χρονικά σημεία της νόσου έδειξε ότι οι διακυμάνσεις στα επίπεδα PSMB5 και LC3II είχαν αντίστροφη σχέση κατά την εξέλιξης της νόσου, υποστηρίζοντας περαιτέρω την αντισταθμιστική σχέση μεταξύ του UPS και της αυτοφαγίας. Πειράματα in vitro επιβεβαίωσαν αυτά τα ευρήματα, με την αναστολή της αυτοφαγίας μέσω Wortmannin να προκαλεί σημαντικά την έκφραση του PSMB5. Επιπλέον, η παρούσα μελέτη κατέδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης της PSMB5 παριστούν έναν πολλά υποσχόμενο προγνωστικό δείκτη για την υποτροπή της νόσου, μετά από θεραπεία με PIs . Αυτά τα ευρήματα πιθανώς να έχουν σημαντική κλινική σημασία, υποδηλώνοντας ότι οι συνδυασμένες θεραπευτικές προσεγγίσεις, που στοχεύουν και στις δύο πρωτεολυτικές οδούς, μπορούν να ξεπεράσουν την αντίσταση και να βελτιώσουν τα αποτελέσματα της θεραπείας σε ασθενείς με ΠM. Επιπλέον, η ενσωμάτωση της αξιολόγησης των επιπέδων της PSMB5, των δεικτών αυτοφαγίας και του οξειδωτικού στρες στην αξιολόγηση των ασθενών θα μπορούσε να προσφέρει πολύτιμα εργαλεία για την πρόβλεψη της ανταπόκρισης στη θεραπεία και τη βελτιστοποίηση εξατομικευμένων θεραπευτικών στρατηγικών στο ΠM.