Development of smart injectable and biodegradable sodium alginate hydrogels for biomedical applications

Abstract

The design of multifunctional three-dimensional (3D) networks offers significant advantages in the field of bioapplications. These systems, often referred to as "smart" networks, respond to stimuli such as changes in temperature, pH, light, etc. Under these conditions, hydrogels can undergo phase transitions, shifting from a liquid state to a 3D network and can swell, shrink, bend, and more. Specifically, the 3D networks that can revert to their initial state in the absence of external stimuli are called "self-healing" materials. Thus, the design and modification of polymer chains contribute to the development of intelligent hydrogels that respond to external factors and can be used as drug carriers, controlling the release rate of active substances or in tissue engineering applications. The aim of this dissertation is the development of "smart" hydrogels using the natural polysaccharide sodium alginate (NaALG) for potential use in bioapplications. For this purpose, the following systems are developed and studied in terms of their viscoelastic properties. Initially, sodium alginate is grafted with thermoresponsive side chains based on poly-N-isopropylacrylamide, enriched with the hydrophobic comonomer N-tert-butylacrylamide, forming NaALG-g-P(NIPAM-co-NtBAM). Then, a doubly grafted sodium alginate is developed, incorporating both the thermoresponsive chains mentioned above and boronic acid groups (BA), which respond to pH changes and glucose concentration, NaALG-g1-P(NIPAM-co-NtBAM)-g2-BA. Finally, a semi-interpenetrating network is created by simply mixing the two separately grafted polymers, NaALG-g-P(NIPAM-co-NtBAM) and NaALG-g-BA. The mechanical properties of these networks are further enhanced by the addition of calcium chloride (CaCl₂). These networks can form through the following crosslinking mechanisms, depending on the grafted groups attached to the alginate polysaccharide: Hydrophobic associations of the thermoresponsive side chains at temperatures above the critical gelation temperature (~24 °C), formation of boronate esters between boronic acid and the diol groups in sodium alginate at physiological pH, ionic interactions between the carboxyl groups of alginate and calcium ions. The resulting hydrogels demonstrate excellent biocompatibility and non-toxicity, as shown in studies using cell lines such as human embryonic kidney cells (HEK 293T) and human periosteum-derived cells (hPDC). These hydrogels exhibit injectability, 3D printability, and self-healing capabilities. The hydrogels based on NaALG-g-P(NIPAM-co-NtBAM) and the semi-interpenetrating networks of NaALG-g-P(NIPAM-co-NtBAM)/NaALG-g-BA are used as 3D-printed materials that support the formation of cell spheroids. In particular, the hydrogel formed by simply mixing NaALG-g-P(NIPAM-co-NtBAM) and NaALG-g-BA promotes the formation of boronate esters between the boronic groups and the diols present in the cell glycocalyx, thereby enhancing cell aggregation. These hydrogels can be used in tissue engineering or preclinical drug screening. The hydrogel formed from the doubly grafted polysaccharide NaALG-g1-P(NIPAM-co-NtBAM)-g2-BA exhibits injectable properties and is used as a drug delivery system in the presence of glucose. The glucose molecule, which contains diols, competes with the boronate esters formed within the 3D network. This hydrogel can be applied in controlled drug delivery systems for Type I diabetes treatment.

Ο σχεδιασμός πολυ-λειτουργικών τρισδιάστατων πλεγμάτων παρουσιάζει ιδιαίτερα πλεονεκτήματα στο χώρο των βιοεφαρμογών. Τα συστήματα αυτά, τα οποία αποκαλούνται και «έξυπνα» δίκτυα, είναι εκείνα που αποκρίνονται σε ερεθίσματα όπως η αλλαγή της θερμοκρασίας, pH, φωτός κ.α. Υπό αυτές τις αλλαγές τα υδροπηκτώματα μπορούν να παρουσιάζουν αλλαγή φάσης, δηλαδή να μεταβούν από την υγρή κατάσταση σε αναπτυσσόμενο δίκτυο, μπορούν να διογκώνονται, να συρρικνώνονται, να κάμπτονται κ.α. Πιο συγκεκριμένα, τα τρισδιάστατα δίκτυα, τα οποία μπορούν να επανέρχονται στην αρχική τους κατάσταση με την απουσία του εξωτερικού ερεθίσματος ονομάζονται «αυτό-ιάσιμα». Συνεπώς, ο σχεδιασμός και η τροποποίηση πολυμερικών αλυσίδων συμβάλει στην ανάπτυξη «ευφυών» υδροπηκτωμάτων υπό την επίδραση εξωγενών παραγόντων, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φορείς φαρμάκων, καθορίζοντας τον ρυθμό αποδέσμευσης της δραστικής ουσίας, ή σε εφαρμογές μηχανικής ιστών. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη «ευφυών» υδροπηκτωμάτων με τη χρήση του φυσικού πολυσακχαρίτη, αλγινικό νάτριο, (NaALG) τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε βιοεφαρμογές. Για τον σκοπό αυτό αναπτύσσονται και μελετώνται ως προς τις ιξωδοελαστικές τους ιδιότητες τα παρακάτω συστήματα. Αρχικά πραγματοποιείται εμβολιασμός του αλγινικού νατρίου με τις θερμοευαίσθητες πλευρικές αλυσίδες βάση το πολύ-Ν-ισοπροπυλ-ακρυλαμίδιο εμπλουτισμένο με το υδρόφοβο συμμονομερές Ν-τερτ-βουτυλ ακρυλαμίδιο, [(P(NIPAM-co-NtBAM)], NaALG-g-P(NIPAM-co-NtBAM). Εν συνεχεία, πραγματοποιείται ανάπτυξη διπλά εμβολιασμένου αλγινικού νατρίου με τις παραπάνω θερμοευαίσθητες αλυσίδες αλλά και με βορονικές ομάδες (ΒΑ) που αποκρίνονται σε αλλαγές του pH και της συγκέντρωσης της γλυκόζης, NaALG-g1-P(NIPAM-co-NtBAM)-g2-BA. Τέλος, αναπτύσσεται ένα ημι-διεισδυόμενο δίκτυο με απλή ανάμειξη των εμβολιασμένων πολυμερών του αλγινικού νατρίου, NaALG-g-P(NIPAM-co-NtBAM) και NaALG-g-ΒΑ. Οι μηχανικές ιδιότητες των δικτύων ενισχύονται περαιτέρω με την προσθήκη χλωριούχου ασβεστίου (CaCl2). Επομένως, τα παραπάνω δίκτυα μπορούν να αναπτύσσονται μέσω των παρακάτω μηχανισμών διασύνδεσης, αναλόγως των εμβολιαζόμενων ομάδων που φέρουν στον αλγινικό πολυσακχαρίτη: Οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις των θερμοευαίσθητων πλευρικών αλυσίδων σε θερμοκρασία υψηλότερη της κρίσιμης θερμοκρασίας σχηματισμού υδροπηκτώματος, η οποία ισούται με ~24 oC, ο σχηματισμός βορονικών εστέρων μεταξύ του βορονικού οξέος και των διολών του αλγινικού νατρίου σε φυσιολογικό pH και οι ιοντικές αλληλεπιδράσεις των καρβοξυλικών ομάδων του αλγινικού με τα ιόντα ασβεστίου. Τα αναπτυσσόμενα υδροπηκτώματα παρουσιάζουν εξαιρετική βιοσυμβατότητα και μη-τοξικότητα όπως παρουσιάζεται από μελέτες με κυτταρικές σειρές όπως, ανθρώπινα εμβρυικά νεφρικά κύτταρα (HEK 293T) ή ανθρώπινα κύτταρα περιόστεου (hPDC). Οι υδρογέλες παρουσιάζουν δυνατότητα ενεσιμότητας, τρισδιάστατης εκτύπωσης και αυτο-ίασης. Τα υδροπηκτώματα του NaALG-g-P(NIPAM-co-NtBAM) καθώς και τα ημι-διεισδυόμενα δίκτυα των NaALG-g-P(NIPAM-co-NtBAM)/ΝaALG-g-ΒΑ χρησιμοποιούνται σαν τρισδιάστατα εκτυπωμένα υλικά που συμβάλλουν στην ανάπτυξη κυτταρικών σφαιριδίων. Ιδιαίτερα, το προερχόμενο υδροπήκτωμα από την απλή ανάμειξη των NaALG-g-P(NIPAM-co-NtBAM) και NaALG-g-ΒΑ, συμβάλει ως προς των σχηματισμό εστέρων μεταξύ των βορονικών ομάδων και των διολών στον γλυκοκάλυκα των κυττάρων, ενισχύοντας τον σχηματισμό κυτταρικών συσσωματωμάτων. Τα παραπάνω υδροπηκτώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε εφαρμογές μηχανικής ιστών ή για προκλινικό έλεγχο φαρμάκων. Το υδροπήκτωμα του διπλά εμβολιασμένου πολυσακχαρίτη, NaALG-g1-P(NIPAM-co-NtBAM)-g2-BA παρουσιάζει ενέσιμες ιδιότητες και χρησιμοποιείται ως φορέας φαρμάκου παρουσία γλυκόζης. Το μόριο της γλυκόζης φέρει διόλες και δρα ανταγωνιστικά στους σχηματιζόμενους βορονικούς εστέρες του τρισδιάστατου δικτύου. Το παραπάνω υδροπήκτωμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε εφαρμογές ελεγχόμενης μεταφοράς φαρμάκων για διαβήτη τύπου Ι.