Production of Systems for the Encapsulation of Bioactive Compounds from Photosynthetic Organisms

Abstract

A wide range of biomolecules derived from photosynthetic organisms are extensively utilized across several industrial sectors, including the pharmaceuticals, cosmetics and food industries. This thesis focuses on the encapsulation of two such bioactive compounds: phycocyanin, a hydrophilic proteinic pigment extracted and purified from the dry biomass of Arthrospira maxima, and curcumin, a hydrophobic antioxidant, naturally found in the turmeric root of Curcuma longa. These compounds were encapsulated into different delivery systems and studied to assess their functionality, with their antioxidant activity serving as the main functional marker for the evaluation of the encapsulation.Initially, a protein-based nanocarrier using bovine serum albumin (BSA) was developed and used to bind curcumin. This approach allowed for curcumin, a hydrophobic molecule, to be indirectly “dissolved” in aqueous media. The protocol developed here involves a near-equimolar protein: curcumin ratio, contrary to the excess of curcumin used in previous studies. Analytical techniques such as fluorescence spectroscopy indicated that curcumin binds near BSA’s tryptophan residues, and circular dichroism confirmed that BSA retained its secondary structure. These results offer a promising platform for non-covalent albumin-based drug carriers, improving curcumin’s solubility and bioavailability.This work was then advanced by exploring a hydrogel-based system designed to co-encapsulate hydrophilic phycocyanin and BSA-bound curcumin. Characterization via optical microscopy, scanning electron microscopy (SEM), and confocal laser scanning microscopy (CLSM) revealed the structure of empty and loaded hydrogels. Antioxidant activity assays confirmed the functional integrity of the encapsulated compounds, while cell viability tests demonstrated the hydrogel’s biocompatibility and non-toxicity, indicating its potential for use in biomedical and pharmaceutical applications.To further address the challenge of co-encapsulating both hydrophilic and hydrophobic compounds, a bicontinuous microemulsion was developed. This transparent and macroscopically monophasic system stabilized by surfactant and cosurfactant molecules, allowed the direct encapsulation of phycocyanin and curcumin without the assistance of BSA. EPR spectroscopy revealed strong radical scavenging activity for both curcumin and phycocyanin, with their combination further enhancing this effect. These findings demonstrate the potential of microemulsions for maintaining the bioactivity of sensitive molecules, such as proteins, which are widely used across multiple application areas.Finally, a protein recombination approach was used to develop a novel protein-based nanocarrier by fusing hydrophobin HFBI with an albumin-binding domain (ABD). This chimeric protein was expressed in E. coli, purified and then used to create curcumin-loaded nanoparticles. These nanoparticles, measured by dynamic light scattering (DLS), exhibited high monodispersity after exposure to human serum albumin (HSA) and retained their size upon incubation. The results demonstrate the successful bacterial production of this chimeric protein and its potential for hydrophobic drug delivery targeting albumin, by using curcumin as hydrophobic core, necessary for the formulation and the stability of the system.In conclusion, this thesis provides valuable insights into various encapsulation methods for natural biomolecules with antioxidant properties. The results underline the ability of different systems to enhance bioactivity, improve stability, and enable targeted delivery, offering significant potential for applications in pharmaceuticals, cosmetics and food industry.

Ένα ευρύ φάσμα βιομορίων που προέρχονται από φωτοσυνθετικούς οργανισμούς χρησιμοποιείται εκτενώς σε διάφορους βιομηχανικούς τομείς, όπως η φαρμακοβιομηχανία, τα καλλυντικά και η βιομηχανία τροφίμων. Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώνεται στην εγκλωβισμό δύο τέτοιων βιοδραστικών ενώσεων: της φυκοκυανίνης, μιας υδρόφιλης πρωτεΐνης που εκχυλίζεται και καθαρίζεται από ξηρή βιομάζα Arthrospira maxima, και της κουρκουμίνης, ενός υδρόφοβου αντιοξειδωτικού που στη φύση συναντάται στη ρίζα του φυτού Curcuma longa. Οι ενώσεις αυτές εγκλωβίστηκαν σε διαφορετικά συστήματα φορέων και μελετήθηκαν ως προς τη λειτουργικότητά τους, με την αντιοξειδωτική τους δράση να αποτελεί τον κύριο λειτουργικό δείκτη για την αξιολόγηση της διαδικασίας εγκλωβισμού.Αρχικά, αναπτύχθηκε ένας νανοφορέας βασισμένος σε πρωτεΐνη, χρησιμοποιώντας αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA), η οποία χρησιμοποιήθηκε για τη δέσμευση της κουρκουμίνης. Η προσέγγιση αυτή επέτρεψε την «έμμεση διάλυση» της κουρκουμίνης, μιας υδρόφοβης ένωσης, σε υδατικά μέσα. Το πρωτόκολλο που αναπτύχθηκε εδώ βασίζεται σε σχεδόν ισομοριακή αναλογία πρωτεΐνης:κουρκουμίνης, σε αντίθεση με προηγούμενες μελέτες στη βιβλιογραφία, όπου χρησιμοποιούσαν περίσσεια του υδρόφοβου μορίου. Αναλυτικές τεχνικές όπως ο φθορισμός μέσω του λεγόμενου « quenching effect» έδειξαν ότι η κουρκουμίνη δεσμεύεται κοντά στα υδρόφοβα τμήματα της BSA όπου εντοπίζεται το αμινοξύ τρυπτόφανη που είναι υπεύθυνο για το φθορισμό, ενώ ο κυκλικός διχρωισμός επιβεβαίωσε ότι η BSA ως επί το πλείστον διατήρησε τη δευτεροταγή της δομή. Τα αποτελέσματα αυτά προσφέρουν μια πολλά υποσχόμενη βάση για φορείς φαρμάκων βασισμένους στην αλβουμίνη, βελτιώνοντας τη διαλυτότητα και βιοδιαθεσιμότητα της κουρκουμίνης και άλλων υδρόφοβων βιομορίων.Η εργασία αυτή επεκτάθηκε στη συνέχεια με τη μελέτη ενός συστήματος υδρογέλης, σχεδιασμένου για τον ταυτόχρονο εγκλωβισμό της υδρόφιλης φυκοκυανίνης και της BSA-συνδεδεμένης κουρκουμίνης. Ο χαρακτηρισμός των υδρογελών, τόσο του άδειου συστήματος όσο και των συστημάτων με εγκλωβισμένα τα βιομόρια, πραγματοποιήθηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM), και συνεστιακή μικροσκοπία. Δοκιμές αντιοξειδωτικής δράσης επιβεβαίωσαν τη λειτουργική ακεραιότητα της εγκλωβισμένης κουρκουμίνης και την επίδραση του περιβάλλοντος υδρογέλης στην αντιοξειδωτική δράση της φυκοκυανίνης, ενώ δοκιμές κυτταρικής βιωσιμότητας ανέδειξαν τη βιοσυμβατότητα και μη τοξικότητα της υδρογέλης, δείχνοντας τη δυνατότητα χρήσης της σε βιοϊατρικές και φαρμακευτικές εφαρμογές.Για την περαιτέρω αντιμετώπιση της πρόκλησης του ταυτόχρονου εγκλωβισμού υδρόφιλων και υδρόφοβων ενώσεων, αναπτύχθηκε ένα δισυνεχές μικρογαλάκτωμα (bicontinuous microemulsion). Το διαυγές και μακροσκοπικά μονοφασικό αυτό σύστημα, σταθεροποιημένο από επιφανειοδραστικά και συν-επιφανειοδραστικά μόρια, επέτρεψε τον εγκλωβισμό της φυκοκυανίνης και της κουρκουμίνης, χωρίς τη χρήση της BSA. Φασματοσκοπία ηλεκτρονικού παραμαγνητικού συντονισμού (EPR) έδειξε ισχυρή ικανότητα εξουδετέρωσης ελευθέρων ριζών και από τις δύο ενώσεις, ενώ ο συνδυασμός τους ενίσχυσε ακόμη περισσότερο το αντιοξειδωτικό αποτέλεσμα. Τα ευρήματα αυτά καταδεικνύουν τις δυνατότητες των μικρογαλακτωμάτων για τη διατήρηση της βιοδραστικότητας ευαίσθητων μορίων, όπως οι πρωτεΐνες, που χρησιμοποιούνται ευρέως σε πολλές εφαρμογές.Τέλος, χρησιμοποιήθηκε μια προσέγγιση πρωτεϊνικού ανασυνδυασμού για την ανάπτυξη ενός καινοτόμου νανοφορέα, μέσω σύντηξης της υδροφοβίνης HFBI με μία μικρή πρωτεϊνική αλληλουχία σύνδεσης αλβουμίνης (ABD). Η χιμαιρική αυτή πρωτεΐνη εκφράστηκε σε E. coli, καθαρίστηκε και χρησιμοποιήθηκε με σκοπό τη δημιουργία νανοσωματιδίων με υδρόφοβο πυρήνα κουρκουμίνης. Τα νανοσωματίδια αυτά, όπως μετρήθηκαν με φασματοσκοπία δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS), εμφάνισαν υψηλή μονοδιασπορά μετά από έκθεση σε ανθρώπινη αλβουμίνη ορού (HSA) και διατήρησαν το μέγεθός τους κατά την επώαση. Τα αποτελέσματα αυτά δίνουν στοιχεία για την επιτυχή βακτηριακή παραγωγή της χιμαιρικής πρωτεΐνης και ενθαρρυντικά προκαταρκτικά δεδομένα για τη δυνατότητά της για στοχευμένη μεταφορά υδρόφοβων φαρμακευτικών ενώσεων με φορέα την αλβουμίνη, χρησιμοποιώντας την κουρκουμίνη ως υδρόφοβο πυρήνα, απαραίτητο για τη διαμόρφωση και σταθερότητα του συστήματος.Συμπερασματικά, η παρούσα εργασία προσφέρει πολύτιμες πληροφορίες για διάφορες μεθόδους εγκλωβισμού φυσικών βιομορίων με αντιοξειδωτικές ιδιότητες, με διαφορετική υδρόφοβη φύση. Τα αποτελέσματα αναδεικνύουν τη δυνατότητα των διαφορετικών συστημάτων να ενισχύσουν τη βιοδραστικότητα, να βελτιώσουν τη σταθερότητα και να επιτρέψουν τη στοχευμένη και συνδυαστική μεταφορά, προσφέροντας σημαντικές προοπτικές εφαρμογής στους τομείς της φαρμακευτικής, των καλλυντικών και της βιομηχανίας τροφίμων.