Ο ρόλος της κυτταρομετρίας ροής στη μελέτη του ορθοκολικού καρκίνου και στην ανάδειξη προγνωστικών παραγόντων

Abstract

Background: Colorectal cancer (CRC) is still accompanied by significant mortality, which poses the necessity of novel markers to predict treatment success and patient survival. Flow Cytometry is an analytical technique for the precise quantification of cellular phenotype. Intraoperative Flow Cytometry (iFC) utilizes flow cytometry during surgery for tissue DNA content/ploidy and cell cycle distribution analysis to identify cancer cells and to evaluate the tumor margins. Various types of cancers, including intracranial, head and neck, breast and liver malignancies have been evaluated with iFC. In the current study, we present an intraoperative Flow Cytometry protocol for colorectal cancer cell detection and potential resection margin evaluation. In addition, we evaluated the prognostic and survival impact of flow cytometry (FC) in CRC patients. Materials and methods: This prospective study includes 106 colorectal cancer patients in which samples from cancer and normal colon epithelium were collected intraoperatively and comparatively assessed with iFC. Patients’ demographics, tumor data and cytometry parameters were assessed. DNA and tumor index were calculated. In a subgroup of 46 patients, the CD26 expression on tumor cells was estimated. These parameters were compared with patients’ tumor characteristics as stage, histology data, responsiveness to treatment, metastasis/recurrence, and, finally, patients’ survival to identify possible new biomarkers. Results: We have demonstrated that a cut-off value of 10.5% for tumor-index (fraction of cells in S and G2/M cell cycle phases) predicts with ~91% accuracy (82.2% sensitivity and 99.9% specificity) the presence of cancer cells. Evaluation of tumor margins by iFC in the subpopulation of rectal cancer patients with or without neoadjuvant therapy, revealed an accuracy of 79% and 88%, respectively. The overall survival and the disease-specific survival in our study group were 76% and 72%, respectively, during the 7-year follow-up period. Diploid tumors had better median survival than the aneuploid ones. The DNA index had significant correlation to the tumor index and response to neoadjuvant treatment. Similarly, the tumor index was also significantly related to the response to neoadjuvant treatment. Patients with a higher tumor index had worst survival rates. Surprisingly, CD26 levels were not associated with any of the parameters examined and were negatively related to tumor stage and differentiation. Conclusion: FC is a rapid and reliable method of cell analysis. In CRC, it has been used for prognostic and diagnostic purposes. Our data supports that regarding colorectal cancer, iFC is a useful adjunct method for tumor cell identification and probably margin evaluation, which could be utilized in rectal cancer treatment in the era of organ sparing procedures. In this study, we have also shown that DNA and tumor index could become predictive biomarkers of tumor response to neoadjuvant treatment and survival of resectable CRC patients.

Εισαγωγή: Ο ορθοκολικός καρκίνος εμφανίζει ολοένα και μεγαλύτερη επίπτωση και θνητότητα τις τελευταίες δεκαετίες, γεγονός που υποδεικνύει την αναγκαιότητα ανάπτυξης νέων προγνωστικών δεικτών για την πρόβλεψη της επιτυχίας της θεραπείας με σκοπό τη βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών. Η κυτταρομετρία ροής είναι μια αναλυτική τεχνική για τον ακριβή ποσοτικό προσδιορισμό του κυτταρικού φαινοτύπου. Η διεγχειρητική κυτταρομετρία ροής (iFC) χρησιμοποιεί την κυτταρομετρία ροής για ανάλυση του κυτταρικού DNA και των φάσεων του κυτταρικού κύκλου από ιστούς που λαμβάνονται διεγχειρητικά, με σκοπό την ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων και την αξιολόγηση των ορίων εκτομής. Διάφοροι τύποι καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των ενδοκράνιων κακοηθειών, όγκων της κεφαλής και τραχήλου, του μαστού και άλλων, έχουν αξιολογηθεί με την iFC. Στην παρούσα μελέτη παρουσιάζουμε ένα διεγχειρητικό πρωτόκολλο κυτταρομετρίας ροής για την ανίχνευση κυττάρων ορθοκολικού καρκίνου και την αξιολόγηση των ορίων εκτομής. Επιπλέον, εκτιμήθηκε η συσχέτιση των κυτταρομετρικών παραμέτρων με την επιβίωση των ασθενών. Υλικά και μέθοδοι: Αυτή η προοπτική μελέτη περιλαμβάνει 106 ασθενείς με χειρουργικά εξαιρέσιμο ορθοκολικό καρκίνο. Διεγχειρητικά λαμβάνονταν από το εντερικό παρασκεύασμα δείγμα φρέσκου φυσιολογικού και καρκινικού ιστού, το οποίο άμεσα μελετούνταν τυφλά με κυτταρομετρία ροής, με σκοπό αρχικά τον καθορισμό του καρκινικού δείγματος και στη συνέχεια τον προσδιορισμό των επιμέρους κυτταρομετρικών παραμέτρων (DNA & Tumor Index). Έγινε καταγραφή των δημογραφικών στοιχείων των ασθενών, των ιστολογικών δεδομένων και των κυτταρομετρικών παραμέτρων. Επιπλέον, σε μια υποομάδα 45 ασθενών, υπολογίστηκε με iFC, η έκφραση του CD26 στα καρκινικά δείγματα. Τα δεδομένα αυτά συσχετίσθηκαν με τα χαρακτηριστικά των όγκων, τα ιστολογικά ευρήματα, την ανταπόκριση στη θεραπεία, την μετάσταση/υποτροπή και, τέλος, με την επιβίωση των ασθενών για τον εντοπισμό πιθανών νέων βιοδεικτών. Αποτελέσματα: Η iFC αποδείχτηκε ότι, με τιμή αποκοπής (cut-off value) 10,5% για τον ΤΙ, μπορεί να διακρίνει με ακρίβεια (~91%) την παρουσία καρκινικών κυττάρων (82.2% ευαισθησία και 99.9% ειδικότητα) στο σύνολο των ασθενών με ορθοκολικό καρκίνο. Στον υποπληθυσμό των ασθενών με καρκίνο του ορθού η ακρίβεια της μεθόδου μειώνεται στο 88% σε αυτούς που δεν έλαβαν νεοεπικουρική θεραπεία και στο 79% για αυτούς που έλαβαν.O δείκτης Tumor index (ΤΙ) συσχετίστηκε θετικά με το βαθμό ανταπόκρισης στη νεοεπικουρική θεραπεία. Οι ασθενείς με υψηλό ΤΙ έχουν στατιστικά σημαντική μείωση της επιβίωσης.Η συνολική επιβίωση (OS) και η επιβίωση ελεύθερης νόσου (DFS) στην ομάδα μελέτης μας ήταν 76% και 72%, αντίστοιχα, κατά τη διάρκεια της 7ετούς περιόδου παρακολούθησης. Οι διπλοειδείς όγκοι είχαν καλύτερη διάμεση επιβίωση από τους ανευπλοειδείς. Ο DNA index είχε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με τον Tumor index και με την ανταπόκριση στη νεοεπικουρική θεραπεία. Ομοίως, ο Tumor index συσχετίστηκε σημαντικά με την ανταπόκριση στη νεοεπικουρική θεραπεία. Οι ασθενείς με υψηλότερο Tumor index είχαν χειρότερα ποσοστά επιβίωσης. Τα επίπεδα CD26 δεν συσχετίστηκαν με καμία από τις παραμέτρους που εξετάστηκαν και παραδόξως, συσχετίστηκαν αρνητικά με το στάδιο του όγκου και το βαθμό διαφοροποίησης. Συμπεράσματα: Η iFC είναι μια γρήγορη και αξιόπιστη μέθοδος κυτταρικής ανάλυσης. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν ότι όσον αφορά τον ορθοκολικό καρκίνο, η iFC είναι μια αξιόπιστη μέθοδος για την αναγνώριση των καρκινικών κυττάρων και την αξιολόγηση των ορίων εκτομής, καθιστώντας την ένα χρήσιμο εργαλείο στις επεμβάσεις όπου τα όρια εκτομής έχουν σημασία. Επιπλέον, οι δείκτες DNA index και Tumor Index φαίνεται να έχουν δυνητική εφαρμογή ως προγνωστικοί βιοδείκτες της ανταπόκρισης του όγκου στη νεοεπικουρική θεραπεία και την επιβίωση ασθενών με ορθοκολικό καρκίνο.