Discovery of bioactive natural products through the exploitation of scientific data obtained by ethnobotanical studies

Abstract

The scopus of this doctorate dissertation is to record and evaluate the ethnopharmacological information in two regions of Greece, as well as to study the ethnopharmacological surveys carried out in the Balkans and the Mediterranean basin, aiming at highlighting the most promising plant species for the discovery of bioactive natural products against skin diseases. The rigorous consulting of the ethnobotanical and ethnopharmacological data revealed the most important plant species in terms of effectiveness and medicinal interest. The 28 selected plants were collected and extracted, and the 87 extracts were further investigated for their chemical profile and their skin healing properties through the evaluation of the inhibitory activity of various skin enzymes such as tyrosinase and collagenase, and their cytotoxic and wound healing effect tested on different cell lines. The two most promising extracts were the methanolic extracts of Momordica charantia L. and Cistus creticus subsp. eriocephalus, for which complete chemical characterisation and isolation of their bioactive constituents were performed. M. charantia fruits are traditionally used as a seed oil preparation and C. creticus subsp. eriocephalus aerial parts are topically applied fresh, as a decoction, or as a poultice. M. charantia fruits were separated from the oil and extracted using successively c-hexane (c-hex), ethyl acetate (EtOAc), methanol (MeOH) and methanol:water (MeOH:H2O) 50:50. GC-MS analysis demonstrated an identical chemical composition of the remaining oil and the c-hex extract, demonstrating that the seed oil is used for the fruits conservation and not because of its wound healing effect which is mainly attributed to the fruit. The methanolic fruit extract (MP extract) after liquid-liquid extraction, was fractionated employing Fast Centrifugal Partition Chromatography (FCPC). Moreover, the species was cultivated, the fruits were lyophilized and extracted using successively EtOAc, MeOH (M extract) and MeOH:H2O 50:50. MP and M extracts were evaluated for cell viability by the 3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay and for their wound healing properties by an in vitro scratch wound assay using HaCat human keratinocytes and L929 murine fibroblasts as skin cell experimental model, exhibiting a low cytotoxic effect and a significant cicatrising activity. C. creticus subsp. eriocephalus aerial parts were extracted using successively dichloromethane (DCM), MeOH and MeOH:H2O 50:50. The methanolic extract (CCM extract) was free from tannins through liquid-liquid extraction and fractionated by Sephadex LH-20 gel column. MP, M and CCM were evaluated for their antioxidant, anti-tyrosinase and anti-collagenase properties, as well as for the total phenolic and flavonoid content. MP, M and CCM were chemically characterised through HPTLC, HPLC-DAD & -ELSD and LC-MS. Structure elucidation of compounds was facilitated by 1D&2D-NMR experiments and revealed the presence of four cucurbitane-type triterpene glycosides for MP and fifteen compounds for CCM among which phenols, flavonoids and tannin derivatives were present. The chemical characterisation of MP, M and CCM extracts by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) indicated the presence of 41, 42 and 46 chemical compounds respectively, some of which were also detected through the isolation and identification by NMR experiments.

Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η καταγραφή και η αξιολόγηση των εθνοφαρμακολογικών αναφορών σε δύο περιοχές της Ελλάδας, καθώς και η μελέτη των εθνοφαρμακολογικών μελετών που πραγματοποιήθηκαν στα Βαλκάνια και σε χώρες της Μεσογείου, με σκοπό την ανάδειξη των πιο ελπιδοφόρων φυτικών ειδών για την ανακάλυψη βιοδραστικών φυσικών προϊόντων για την αντιμετώπιση των δερματικών παθήσεων. Η εξονυχιστική μελέτη των εθνοβοτανικών και εθνοφαρμακολογικών δεδομένων ανέδειξε τα πιο δραστικά φυτικά είδη. Τα 28 φυτά συλλέχθηκαν και εκχυλίστηκαν, και τα 87 εκχυλίσματα διερευνήθηκαν περαιτέρω ως προς το χημικό τους προφίλ και τις θεραπευτικές τους ιδιότητες για την αντιμετώπιση παθήσεων του δέρματος. Πιο συγκεκριμένα αξιολογήθηκε η ανασταλτική δράση των εκχυλισμάτων έναντι των ενζύμων τυροσινάση και κολλαγενάση, καθώς και η κυτταροτοξική και επουλωτική δράση τους σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Τα δύο εκχυλίσματα που επιλέχθηκαν ήταν τα μεθανολικά εκχυλίσματα των φυτών Momordica charantia L. and Cistus creticus subsp. eriocephalus, για τα οποία πραγματοποιήθηκε πλήρης χημικός χαρακτηρισμός και απομόνωση των βιοδραστικών τους συστατικών. Με βάση τη λαϊκή θεραπευτική της κεντρικής Μακεδονίας οι καρποί του φυτού M. charantia βυθίζονται σε ηλιέλαιο και το παρασκεύασμα χρησιμοποιείται για τις επουλωτικές του ιδιότητες ενώ τα υπέργεια τμήματα του φυτού C. creticus subsp. eriocephalus χρησιμοποιούνται παραδοσιακά με τοπική εφαρμογή ως κατάπλασμα ή αφέψημα για την ίδια θεραπευτική ένδειξη. Στα πλαίσια της πειραματικής διαδικασίας οι καρποί του M. charantia διαχωρίστηκαν από το έλαιο στο οποίο ήταν εμβαπτισμένοι και εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας διαδοχικά κυκλοεξάνιο (c-hex), οξικό αιθυλεστέρα (EtOAc), μεθανόλη (MeOH) και μεθανόλη:νερό (MeOH:H2O) 50:50. Η ανάλυση με αέρια χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας έδειξε πως η χημική σύσταση του ελαίου που περιείχε τον καρπό και του κυκλοεξανικού εκχυλίσματος είναι όμοιες αποδεικνύοντας πως το έλαιο δεν παραλαμβάνει δραστικά χημικά συστατικά και πως η δράση οφείλεται στις ουσίες που περιέχονται στον καρπό. Το μεθανολικό εκχύλισμα του καρπού (εκχύλισμα MP) μετά από υγρή-υγρή εκχύλιση, κλασματώθηκε με τη χρήση της φυγόκεντρου χρωματογραφίας κατανομής (FCPC). Επιπλέον, το φυτικό είδος καλλιεργήθηκε και οι καρποί λυοφιλοποιήθηκαν και εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας διαδοχικά EtOAc, MeOH (εκχύλισμα M) και MeOH:H2O 50:50. Για τα εκχυλίσματα Μ και ΜP πραγματοποιήθηκε η βιολογική αξιολόγηση επουλωτικής δράσης in vitro σε κερατινοκύτταρα (HaCaT) και ινοβλάστες (L929), καθώς και έλεγχος κυτταροτοξικότητας με τη χρήση χρωστικής MTT, επιδεικνύοντας χαμηλή κυτταροτοξική δράση και σημαντική επουλωτική δράση. Τα υπέργεια τμήματα του C. creticus subsp. eriocephalus εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας διαδοχικά διχλωρομεθάνιο (DCM), MeOH και MeOH:H2O 50:50. Οι ταννίνες απομακρύνθηκαν από το μεθανολικό εκχύλισμα (εκχύλισμα CCM) μέσω υγρής-υγρής εκχύλισης και το εκχύλισμα κλασματώθηκε μέσω χρωματογραφίας μοριακού αποκλεισμού (Sephadex). Τα εκχυλίσματα MP, M και CCM αξιολογήθηκαν για την αντιοξειδωτική τους ικανότητα, την ανασταλτική δράση έναντι των ενζύμων τυροσινάση και κολλαγενάση, καθώς προσδιορίστηκε επιπλέον το ολικό φαινολικό φορτίο και το ολικό φορτίο φλαβονοειδών. Ο χημικός χαρακτηρισμός των εκχυλισμάτων MP, M και CCM έγινε με Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας Υψηλής Απόδοσης (HPTLC), Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC-DAD & -ELSD) και Υγρή Χρωματογραφία/Φασματομετρία Μάζας (LC-MS). Η ταυτοποίηση χημικών ουσιών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR) για τα εκχυλίσματα MP και CCM υποδεικνύοντας την παρουσία τριτερπενικών γλυκοσίδων στο MP και φαινολών, φλαβονοειδών και ταννινών στο CCM. Ο χημικός χαρακτηρισμός των MP, M και CCM με τη χρήση LC-MS υπέδειξε την παρουσία 41, 42 και 46 χημικών συστατικών αντίστοιχα, κάποια από τα οποία εντοπίστηκαν και με τη χρήση πειραμάτων NMR.