Ο ρόλος των λειτουργικών στοιχείων του γονιδιώματος στην εξέλιξη των προγραμμάτων γονιδιακής έκφρασης κατά την κυτταρική απόκριση στη διάρκεια ιϊκών μολύνσεων

Abstract

Viral infections are major causes of morbidity and mortality worldwide, causing significant impacts on human health and often leading to pandemics. Viruses play a critical role in the development of multifactorial diseases, which arise from the interaction of environmental factors and microbial load. The entrance of viral genetic information into host cells often causes molecular disorders, leading to the appearance of complex pathological phenotypes. Examples of diseases associated with viral infections include Type 1 Diabetes Mellitus (T1DM), Ebola disease, Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS), Hepatitis B and C, as well as other autoimmune diseases. The recent COVID-19 pandemic, caused by the SARS-CoV-2 virus, has highlighted the potential of viruses to destabilize the homeostasis of the human body, causing significant impacts on health and longevity. In modern biomedical research, understanding the relationship between environmental factors—such as microorganisms, chemicals, radiation, nutrition, and stress—and genetic parameters, i.e. mutations in the human genome, is considered crucial for understanding the emergence, evolution, and spread of diseases in human populations. At the molecular level, the entrance of the viruses causes reprogramming of the transcriptional profile of cells, disrupting the gene expression programs that support homeostatic mechanisms. This often leads to the appearance of pathological phenotypes, accompanied by a disruption of the defense/immune response, which facilitates the development of diseases. The ability of cells to mount complex defense responses against microbial pathogens, such as viruses, is fundamental to maintaining human health. However, the (epi)genomic mechanisms involved in the adaptation of these responses are not fully understood. A key limitation in understanding these mechanisms is the insufficient mapping of functional cis-Regulatory Modules (CRMs) in the human genome, which regulate gene expression in vivo. The investigation of these regulatory mechanisms is essential for elucidating the molecular basis of the human body’s defense responses and for the development of new therapeutic approaches for the effective treatment of viral infections.T1DM is characterized as one of the most damaging autoimmune diseases of the pancreas, causing the destruction of pancreatic β cells and affecting millions of people worldwide. Over the past three decades, the incidence of the disease has increased significantly. However, despite advances in research, the molecular mechanisms underlying the development of T1DM remain unclear, and the precise association between the presence of viruses in the human body and the development of the disease has not been determined. Studies involving patients with T1DM indicate that viral infections, and in particular enteroviruses, are important environmental risk factors for the development of the disease. In addition, genes that are activated or induced by viruses, such as IRF7 and IFIH1, have been strongly associated with the development of the autoimmune phenotype of T1DM. At the same time, Genome-Wide Association Studies (GWAS) have identified genetic regions with Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), which increase the genetic predisposition to the development of the disease. Based on the above, the scientific hypothesis arises that specific regions of regulatory DNA, which function as “regulators” of gene expression during the antiviral cellular response, may contribute to the pathogenesis of T1DM. This hypothesis is strengthened by the fact that mutations in these regions may alter their activity, causing an abnormal antiviral response and, ultimately, the manifestation of the disease. Further investigation of these mechanisms is necessary to understand the interaction between environmental and genetic factors, as well as to develop new therapeutic approaches for T1DM.The aim of this PhD Thesis, entitled “The Role of Functional Elements of the Genome in the Evolution of Gene Expression Programs during the Cellular Response to Viral Infections”, is to decode and understand the molecular mechanisms that regulate gene expression in mammalian cells during viral infections. The PhD Thesis focuses on identifying functional elements of the genome, which regulate gene expression under conditions of viral infection and examines how these regions change in the organism’s response, through a comprehensive experimental approach at the genome-wide level. The experimental strategy of the PhD Thesis combines the most advanced methods of Cell Biology, Molecular Biology, Biochemistry, Genomics, Bioinformatics and Computational Biology, to acquire new knowledge for understanding the effect of viral infections on gene regulation. The results of this PhD Thesis contributed significantly to the in-depth understanding of the molecular mechanism underlying the establishment of virus-induced gene expression programs in human epithelial HeLa cells, Namalwa B lymphocytes, human and mouse pancreatic β cells. The findings of the PhD Thesis highlighted critical elements regarding the regulation of antiviral gene induction and the functional organization of the (epi)genome, revealing extensive chromatin regions/gene coordinates/gene coordinates, which are specialized in gene expression related to defense and antimicrobial responses. In particular, the findings of the PhD Thesis revealed key elements regarding the regulation of antiviral gene induction and the functional organization of the (epi)genome, revealing extensive chromatin regions/gene coordinates/gene coordinates specialized in the regulation of gene expression related to defense and antimicrobial responses. At the same time, novel virus-induced CRMs, such as typical enhancers (tEs), super-enhancers (SEs) and repetitive DNA enhancers (rDEs), were identified. These regulatory elements proved to be crucial for the activation of innate immunity during infection and the maintenance of cellular homeostasis under physiological conditions. Particular importance was given to the investigation of the DNA “Grammar” and “Syntax” of sequences, with the aim of better understanding the organizational architecture of the genome, which affects the antiviral responses of the organism. In addition, the evolutionary conservation of these regulatory elements from humans to microbes was studied, revealing how mammalian (epi)genomes have evolved to respond to exogenous challenges, such as viral infections, by activating adaptive defense transcriptional responses. Furthermore, it was discovered that after viral infection, certain transposable elements (TEs) are activated, producing RNA molecules that affect the function of neighboring antiviral genes and their regulatory regions, thus identifying new aspects of gene regulation during viral infection. Finally, a significant discovery was the identification of single nucleotide polymorphisms (SNPs), which are associated with autoimmune diseases and are located in regions of the genome that are in cis proximity and/or within critical regulatory elements. These SNPs may determine the individual genetic predisposition to the development of autoimmune diseases, the differentiated response of the organism to viral infections. Overall, this PhD Thesis offers valuable insights into the function, architecture and evolutionary origin of the human and mouse (epi)genome. These findings open new perspectives for understanding the importance of the genome in maintaining homeostasis, as well as in addressing the challenges caused by microbial and viral agents, contributing to the development of innovative therapeutic strategies for the treatment of autoimmune and viral diseases.

Οι ιϊκές μολύνσεις αποτελούν σοβαρούς παράγοντες νοσηρότητας και θνησιμότητας παγκοσμίως, προκαλώντας σημαντικές επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία και συχνά οδηγώντας στην εμφάνιση πανδημιών. Οι ιοί διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη πολυπαραγοντικών ασθενειών, οι οποίες προκύπτουν από την αλληλεπίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων και μικροβιακού φορτίου. Η εισαγωγή της γενετικής πληροφορίας των ιών στα κύτταρα του ξενιστή προκαλεί συχνά μοριακές διαταραχές, που οδηγούν στην εμφάνιση πολύπλοκων παθολογικών φαινοτύπων. Παραδείγματα νοσημάτων που σχετίζονται με ιϊκές μολύνσεις περιλαμβάνουν τον Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου 1 (ΣΔΤ1), τη νόσο του Έμπολα, το Σύνδρομο Επίκτητης Ανοσολογικής Ανεπάρκειας (Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS), την Ιογενή Ηπατίτιδα B και C, καθώς και άλλες αυτοάνοσες παθήσεις. Η πρόσφατη πανδημία COVID-19, που προκλήθηκε από τον ιό SARS-CoV-2, ανέδειξε τη δυναμική των ιών να αποσταθεροποιούν την ομοιόσταση του ανθρώπινου οργανισμού, προκαλώντας σημαντικές επιπτώσεις στην υγεία και τη μακροζωία. Στη σύγχρονη βιοϊατρική έρευνα, η κατανόηση της σχέσης μεταξύ περιβαλλοντικών παραγόντων—όπως οι μικροοργανισμοί, οι χημικές ουσίες, η ακτινοβολία, η διατροφή και το άγχος—και των γενετικών παραμέτρων, δηλαδή των μεταλλάξεων στο ανθρώπινο γονιδίωμα, θεωρείται καθοριστική για την κατανόηση της εμφάνισης, εξέλιξης και διασποράς των νοσημάτων στους ανθρώπινους πληθυσμούς. Σε μοριακό επίπεδο, η είσοδος των ιών στα κύτταρα προκαλεί επαναπρογραμματισμό του μεταγραφικού τους προφίλ, διαταράσσοντας τα γονιδιακά προγράμματα που υποστηρίζουν τους ομοιοστατικούς μηχανισμούς. Αυτό συχνά οδηγεί στην εμφάνιση παθολογικών φαινοτύπων, συνοδευόμενων από διαταραχή της αμυντικής/ανοσολογικής απόκρισης, γεγονός που διευκολύνει την ανάπτυξη ασθενειών. Η ικανότητα των κυττάρων να αναπτύσσουν σύνθετες αμυντικές αποκρίσεις έναντι μικροβιακών παθογόνων, όπως οι ιοί, αποτελεί θεμελιώδη παράγοντα για τη διατήρηση της ανθρώπινης υγείας. Ωστόσο, οι (επι)γονιδιωματικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην προσαρμογή αυτών των αποκρίσεων δεν έχουν κατανοηθεί πλήρως. Ένας βασικός περιορισμός στην κατανόηση αυτών των μηχανισμών είναι η ανεπαρκής καταγραφή των λειτουργικών ρυθμιστικών στοιχείων DNA cis-δράσης (Cis-Regulatory Modules, CRMs) στο ανθρώπινο γονιδίωμα, τα οποία ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων in vivo. Η διερεύνηση αυτών των ρυθμιστικών μηχανισμών είναι απαραίτητη για την αποσαφήνιση της μοριακής βάσης των αμυντικών αποκρίσεων του ανθρώπινου οργανισμού και για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για την αποτελεσματική αντιμετώπιση των ιϊκών μολύνσεων. Ο ΣΔΤ1 χαρακτηρίζεται ως μία από τις πλέον επιβλαβείς αυτοάνοσες νόσους του παγκρέατος, προκαλώντας την καταστροφή των β παγκρεατικών κυττάρων και επηρεάζοντας εκατομμύρια ανθρώπους παγκοσμίως. Τις τελευταίες τρεις δεκαετίες, η συχνότητα εμφάνισης της νόσου έχει αυξηθεί σημαντικά. Ωστόσο, παρά την πρόοδο στην έρευνα, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν την ανάπτυξη του ΣΔΤ1 παραμένουν ασαφείς, ενώ δεν έχει καθοριστεί η ακριβής συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας ιών στον ανθρώπινο οργανισμό και της ανάπτυξης της νόσου. Μελέτες που αφορούν ασθενείς με ΣΔΤ1 δείχνουν ότι οι ιϊκές μολύνσεις, και ιδιαιτέρως οι εντεροϊοί, αποτελούν σημαντικούς περιβαλλοντικούς παράγοντες κινδύνου για την εκδήλωση της νόσου. Επιπλέον, γονίδια που ενεργοποιούνται ή επάγονται από ιούς, όπως τα IRF7 και IFIH1, έχουν συνδεθεί ισχυρά με την ανάπτυξη του αυτοάνοσου φαινοτύπου του ΣΔΤ1. Παράλληλα, μελέτες γονιδιωματικής συσχέτισης (Genome-Wide Association Studies, GWAS) έχουν εντοπίσει γενετικές περιοχές με μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs), οι οποίες αυξάνουν τη γενετική προδιάθεση για την εμφάνιση της νόσου. Με βάση τα παραπάνω, προκύπτει η επιστημονική υπόθεση ότι συγκεκριμένες περιοχές του ρυθμιστικού DNA, οι οποίες λειτουργούν ως «ροοστάτες» της γονιδιακής έκφρασης κατά την αντιιϊκή κυτταρική απόκριση, δύνανται να συμβάλλουν στην παθογένεση του ΣΔΤ1. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται από το γεγονός ότι μεταλλάξεις στις περιοχές αυτές μπορεί να μεταβάλουν τη δραστικότητά τους, προκαλώντας ανώμαλη αντιιϊκή απόκριση και, τελικά, την εκδήλωση της νόσου. Η περαιτέρω διερεύνηση των μηχανισμών αυτών είναι απαραίτητη για την κατανόηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ περιβαλλοντικών και γενετικών παραγόντων, καθώς και για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για τον ΣΔΤ1. Ο σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής, με τίτλο «Ο Ρόλος των Λειτουργικών Στοιχείων του Γονιδιώματος στην Εξέλιξη των Προγραμμάτων Γονιδιακής Έκφρασης κατά την Κυτταρική Απόκριση στη Διάρκεια Ιϊκών Μολύνσεων», είναι η αποκρυπτογράφηση και κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση σε κύτταρα θηλαστικών κατά τη διάρκεια ιϊκών μολύνσεων. Η μελέτη εστιάζει στην αναγνώριση των λειτουργικών στοιχείων του γονιδιώματος, τα οποία ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση σε συνθήκες ιϊκής μόλυνσης και εξετάζει πώς αυτές οι περιοχές μεταβάλλονται στην αντίδραση του οργανισμού, μέσω μίας ολοκληρωμένης πειραματικής προσέγγισης σε επίπεδο ολόκληρου του γονιδιώματος. Η πειραματική στρατηγική της Διδακτορικής Διατριβής συνδυάζει τις πλέον προηγμένες μεθόδους Κυτταρικής Βιολογίας, Μοριακής Βιολογίας, Βιοχημείας, Γονιδιωματικής, Βιοπληροφορικής και Υπολογιστικής Βιολογίας, με στόχο την απόκτηση νέας γνώσης για την κατανόηση της επίδρασης των ιϊκών μολύνσεων στη ρύθμιση των γονιδίων. Τα αποτελέσματα της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής συνέβαλαν καθοριστικά στην εις βάθος κατανόηση του μοριακού μηχανισμού που διέπει την εγκαθίδρυση των ιϊκά επαγόμενων προγραμμάτων γονιδιακής έκφρασης σε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα HeLa, B λεμφοκύτταρα Namalwa, καθώς και β παγκρεατικά κύτταρα ανθρώπου και ποντικού. Τα ευρήματα της μελέτης ανέδειξαν κρίσιμα στοιχεία σχετικά με τη ρύθμιση της επαγωγής αντιιϊκών γονιδίων και τη λειτουργική οργάνωση του (επι)γονιδιώματος, αποκαλύπτοντας εκτεταμένες χρωματινικές περιοχές, οι οποίες είναι εξειδικευμένες στη γονιδιακή έκφραση που σχετίζεται με αμυντικές και αντιμικροβιακές αποκρίσεις. Ειδικότερα, τα ευρήματα της Διδακτορικής Διατριβής ανέδειξαν βασικά στοιχεία σχετικά με τη ρύθμιση της επαγωγής αντιιϊκών γονιδίων, καθώς και τη λειτουργική οργάνωση του (επι)γονιδιώματος, αποκαλύπτοντας εκτεταμένες χρωματινικές περιοχές με εξειδίκευση στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης που σχετίζεται με αμυντικές και αντιμικροβιακές αποκρίσεις. Παράλληλα, εντοπίστηκαν νέα ιϊκά επαγόμενα ρυθμιστικά στοιχεία του DNA (CRMs), όπως τυπικοί ενισχυτές (typical Enhancers, tEs), υπερ-ενισχυτές (Super-Enhancers, SEs) και επαναλαμβανόμενες (concatemerized) επιμήκεις μονάδες ενισχυτών (repetitive DNA enhancers, rDEs). Αυτά τα ρυθμιστικά στοιχεία αποδείχθηκαν καίρια για την ενεργοποίηση της βασικής ανοσίας κατά τη διάρκεια της μόλυνσης και τη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης σε φυσιολογικές συνθήκες. Ιδιαίτερη σημασία αποδόθηκε στη διερεύνηση της «γραμματικής» και του «συντακτικού» των αλληλουχιών του DNA (DNA Grammar & Syntax), με σκοπό την καλύτερη κατανόηση της οργανωτικής αρχιτεκτονικής του γονιδιώματος, η οποία επηρεάζει τις αντιιϊκές αποκρίσεις του οργανισμού. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η εξελικτική συντήρηση αυτών των ρυθμιστικών στοιχείων από τον άνθρωπο έως τα μικρόβια, αποκαλύπτοντας τον τρόπο με τον οποίο τα (επι)γονιδιώματα των θηλαστικών έχουν εξελιχθεί για να ανταποκριθούν σε εξωγενείς προκλήσεις, όπως οι ιϊκές μολύνσεις, ενεργοποιώντας προσαρμοστικές αμυντικές μεταγραφικές αποκρίσεις. Επιπλέον, ανακαλύφθηκε ότι μετά από την ιϊκή μόλυνση, ορισμένα μεταθετά στοιχεία (Transposable Elements, TEs) ενεργοποιούνται, παράγοντας μόρια RNA που επηρεάζουν τη λειτουργία γειτονικών αντιιϊκών γονιδίων και των ρυθμιστικών περιοχών τους, προσδιορίζοντας έτσι νέες πτυχές της γονιδιακής ρύθμισης κατά την ιϊκή μόλυνση. Τέλος, σημαντική ανακάλυψη αποτέλεσε ο εντοπισμός μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNPs), οι οποίοι συνδέονται με αυτοάνοσα νοσήματα και εντοπίζονται σε περιοχές του γονιδιώματος που βρίσκονται σε in cis εγγύτητα ή/και εντός κρίσιμων ρυθμιστικών στοιχείων. Αυτά τα SNPs ενδέχεται να προσδιορίζουν την ατομική γενετική προδιάθεση για την ανάπτυξη αυτοάνοσων νοσημάτων, καθώς και τη διαφοροποιημένη αντίδραση των οργανισμών σε ιϊκές μολύνσεις. Συνολικά, η παρούσα Διδακτορική Διατριβή προσφέρει πολύτιμες γνώσεις σχετικά με τη λειτουργία, την αρχιτεκτονική και την εξελικτική προέλευση του (επι)γονιδιώματος του ανθρώπου και του ποντικού. Τα ευρήματα αυτά ανοίγουν νέες προοπτικές για την κατανόηση της σημασίας του γονιδιώματος στην διατήρηση της ομοιόστασης, καθώς και στην αντιμετώπιση των προκλήσεων που προκαλούνται από μικροβιακούς και ιϊκούς παράγοντες, συμβάλλοντας στην ανάπτυξη καινοτόμων θεραπευτικών στρατηγικών για την αντιμετώπιση αυτοάνοσων και ιϊκών νοσημάτων.