Investigating the protein-membrane interface in peripheral membrane proteins using molecular simulations

Abstract

Abnormal protein-membrane attachment is involved in deregulated cellular signaling pathways and in disease, hence, the possibility to modulate this interaction represents a new promising therapeutic strategy for many diseases. A representative example is the PI3Kα/PTEN/Akt signaling pathway, which is mediated by two peripheral membrane proteins, PI3Kα and PTEN, whose deregulated protein-membrane attachment is associated with various diseases including cancer. As peripheral membrane proteins, PI3Kα and PTEN, bind transiently to the membrane where they become activated. The transient nature of their membrane- binding poses significant challenges in assessing their active conformation on the membrane and thus the conformation of their active state of both proteins remains elusive, further complicating the drug targeting. This PhD thesis investigates the protein-membrane interface and allosteric modulation of these two major peripheral membrane proteins, PI3Kα and PTEN. Using molecular simulations, this study explores three primary objectives: 1) the mechanism of PI3Kα C-terminal activation and the dynamics of its active-like membrane-bound state are elucidated, 2) the allosteric modulation and dynamics of PTEN across different states of its catalytic cycle are assessed, and 3) druggable allosteric pockets are identified, and small-molecule allosteric modulators are designed to modify the protein-membrane interactions of PI3Kα and PTEN. The mechanisms of PI3Kα C-terminal activation are investigated in both WT and a spectrum of oncogenic C-terminal mutants. Free energy landscapes describing C-terminal activation for each system are constructed, and the findings were consistent with HDX-MS experimental data providing a molecular explanation for the different C-terminal activation mechanisms by which the oncogenic mutants reorient the C-terminus, compared to the WT. Considering that PI3Kα is the most frequently mutated kinase in all human cancers, drug design targeting this protein is also explored using the recently identified allosteric STX-478 pocket. Novel putative modulators were designed, using known allosteric inhibitors as scaffolds, and proposed for synthesis and experimental validation. As PI3Kα activation occurs on the membrane, a model of the active-like state of PI3Kα WT and the H1047R mutant in complex with HRAS on a model membrane was constructed and simulated for the first time. This study revealed key structural and dynamical changes induced by the H1047R mutation, providing a mechanistic basis for the enhanced membrane-binding ability observed in the H1047R oncogenic mutant. Another aim of this research was to study the different states of PTEN catalytic cycle, including its cytosolic state and its active state on the membrane. Simulations of PTEN in solution and on a model membrane were performed, highlighting differences between these states and elucidating the dynamics of its intrinsically disordered but functionally critical N-terminal and C-terminal regions. Using representative structures from these simulations, druggable allosteric pockets were predicted, and several candidate small-molecule PTEN modulators were designed and experimentally validated, one of which emerged as the first promising small-molecule inhibitor of PTEN. Overall, in the present PhD thesis, a computational framework was established to explore the conformational space of two critical drug targets, PI3Kα and PTEN. By integrating computational findings with experimental data, atomistic-level insights were provided, offering novel molecular understanding that could be exploited for the development of innovative cancer therapeutic strategies.

Η μη φυσιολογική πρόσδεση πρωτεΐνης-μεμβράνης εμπλέκεται σε απορυθμισμένα κυτταρικά μονοπάτια και σε πολλαπλές ασθένειες, καθιστώντας τη ρύθμιση αυτής της αλληλεπίδρασης μια νέα ελπιδοφόρα θεραπευτική στρατηγική για πολλές ασθένειες. Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα είναι η οδός σηματοδότησης PI3Kα/PTEN/Akt, η οποία διαμεσολαβείται από δύο περιφερειακές μεμβρανικές πρωτεΐνες, τις PI3Kα και PTEN, των οποίων η απορρυθμισμένη πρόσδεση στη μεμβράνη συνδέεται με διάφορες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Ως περιφερειακές μεμβρανικές πρωτεΐνες, οι PI3Kα και PTEN προσδένονται παροδικά στη μεμβράνη, όπου ενεργοποιούνται. Η παροδική φύση της πρόσδεσής τους στη μεμβράνη δημιουργεί σημαντικές προκλήσεις στον χαρακτηρισμό της ενεργής τους διαμόρφωσης στη μεμβράνη και, κατά συνέπεια, η διαμόρφωση της ενεργής τους κατάστασης παραμένει ασαφής, περιπλέκοντας περαιτέρω τη στόχευση με φάρμακα. Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή εξετάζει τη διεπιφάνεια πρωτεΐνης-μεμβράνης και την αλλοστερική τροποποίηση αυτών των δύο σημαντικών περιφερειακών μεμβρανικών πρωτεϊνών, της PI3Kα και της PTEN. Χρησιμοποιώντας μοριακές προσομοιώσεις, η μελέτη αυτή εξερευνά τρεις βασικούς στόχους: 1) τον μηχανισμό ενεργοποίησης του C-τελικού άκρου της PI3Kα και τη δυναμική της ενεργής κατάστασής της στη μεμβράνη, 2) την αλλοστερική τροποποίηση και τη δυναμική της PTEN κατά τη διάρκεια διαφορετικών καταστάσεων του καταλυτικού της κύκλου, και 3) τον εντοπισμό αλλοστερικών περιοχών που μπορούν να στοχευθούν φαρμακολογικά, καθώς και τον σχεδιασμό μικρών μορίων αλλοστερικών τροποποιητών για την τροποποίηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-μεμβράνης των PI3Kα και PTEN. Οι μηχανισμοί ενεργοποίησης του C-τελικού άκρου της PI3Kα διερευνώνται τόσο στον φυσιολογικό τύπο (WT) όσο και σε ένα φάσμα ογκογόνων μεταλλάξεων του C-τελικού άκρου. Κατασκευάστηκαν οι επιφάνειες ελεύθερης ενέργειας που περιγράφουν την ενεργοποίηση του C-τελικού άκρου για κάθε σύστημα, και τα ευρήματα ήταν σύμφωνα με τα πειραματικά δεδομένα HDX-MS, παρέχοντας μοριακή εξήγηση για τους διαφορετικούς μηχανισμούς ενεργοποίησης του C-τελικού άκρου που χρησιμοποιούν οι ογκογόνες μεταλλάξεις για να ανακατευθύνουν το C-τελικό άκρο σε σύγκριση με τον WT. Δεδομένου ότι η PI3Kα είναι η συχνότερα μεταλλαγμένη κινάση σε όλους τους ανθρώπινους καρκίνους, σχεδιάστηκαν υποψήφια φάρμακα που στοχεύουν αυτήν την πρωτεΐνη χρησιμοποιώντας την πρόσφατα ανακαλυφθείσα αλλοστερική κοιλότητα του μορίου STX-478. Σχεδιάστηκαν νέοι υποψήφιοι τροποποιητές, χρησιμοποιώντας ως καλούπια γνωστούς αλλοστερικούς αναστολείς, οι οποίοι προτάθηκαν για σύνθεση και πειραματική μελέτη. Καθώς η ενεργοποίηση της PI3Kα πραγματοποιείται στη μεμβράνη, κατασκευάστηκε και προσομοιώθηκε για πρώτη φορά ένα μοντέλο της ενεργής διαμόρφωσης της PI3Kα WT και της μετάλλαξης H1047R σε σύμπλοκο με HRAS σε ένα μοντέλο μεμβράνης. Αυτή η μελέτηαποκάλυψε βασικές δομικές και δυναμικές αλλαγές που προκαλούνται από τη μετάλλαξη H1047R, παρέχοντας μηχανιστική βάση για την αυξημένη ικανότητα πρόσδεσης στη μεμβράνη που παρατηρείται στη συγκεκριμένη ογκογόνο μετάλλαξη. Ένας ακόμη στόχος αυτής της έρευνας ήταν η μελέτη των διαφορετικών καταστάσεων του καταλυτικού κύκλου της PTEN, συμπεριλαμβανομένης της κυτταροπλασματικής της κατάστασης και της ενεργής της κατάστασης στη μεμβράνη. Πραγματοποιήθηκαν προσομοιώσεις της PTEN σε διαλύτη και σε ένα μοντέλο μεμβράνης, αναδεικνύοντας διαφορές μεταξύ αυτών των καταστάσεων και περιγράφοντας τη δυναμική των εγγενώς αδιάτακτων αλλά λειτουργικά κρίσιμων N- και C-τελικών περιοχών της πρωτεΐνης. Χρησιμοποιώντας αντιπροσωπευτικές δομές από αυτές τις προσομοιώσεις, προβλέφθηκαν αλλοστερικές κοιλότητες που μπορούν να στοχευθούν φαρμακολογικά. Σχεδιάστηκαν υποψήφια μόρια-ρυθμιστές της PTEN, τα οποία μελετήθηκαν πειραματικά, και ένα από αυτά αναδείχθηκε ως ο πρώτος υποσχόμενος αναστολέας της PTEN.Συνολικά, στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή, δημιουργήθηκε ένα υπολογιστικό πλαίσιο για την εξερεύνηση του διαμορφωτικού χώρου δύο κρίσιμων φαρμακευτικών στόχων, της PI3Kα και της PTEN. Ενσωματώνοντας υπολογιστικά ευρήματα με πειραματικά δεδομένα, παρέχονται ατομικού επιπέδου πληροφορίες, προσφέροντας νέα μοριακή κατανόηση που μπορεί να αξιοποιηθεί για την ανάπτυξη καινοτόμων θεραπευτικών στρατηγικών για τον καρκίνο.