Πρωτεϊνική μηχανική και μελέτη λυτικών ενζύμων για την καταπολέμηση των ανθεκτικών βακτηρίων

Abstract

Multiple Bacterial Resistance which has been recognized as the negative outcome of the constant and repeated application of antibiotics, jeopardize their effects in the field of human health, as this phenomenon takes on dimensions of a global crisis. The discovery of many well-known antibiotics, has always been followed by excessive and irrational use, leading to the appearance bacteria that resist their activity. The fact that, nowadays, infectious deceases caused by microorganisms cannot been cured by antibiotics, makes it a global threat and a major public health issue. In view of multiple resistance, the current project focuses on the cases of multidrug resistant bacteria, which cause dangerous infections in humans across the world, because of this antibiotic resistance mechanisms. The immediate threat to human health is driving researchers into the development of new and innovative antibacterial agents. Lytic enzymes, originated from bacteriophages (endolysins or or enzymes-antibiotics - “Enzybiotics”) hydrolyzing the cell wall of their host, exhibit specificity for the host bacterium at genus level and in some cases down to strain level within the same species. This characteristic makes endolysins a potential alternative or additional compound in modern antibiotics. As the main objective of the current project has been the discovery and evaluation of novel agents capable of alleviating multiple resistance, the first steps aim at the multi-resistant pathogenic bacteria Acinetobacter baumannii and Enterococcus faecium. The study focuses on the discovery of new peptidoglycan hydrolytic enzymes, the Enzybiotics. The use of phage therapy or phage-derived enzymes against bacterial diseases has not been a new strategy. However, the requirement of enzymes with unique physicochemical properties can be fulfilled by functional genomics and by investigating special environmental conditions. The first step was a comparative study using peptidoglycan hydrolases, namely AbLys1 from Acinetobacter phage TZA1 infecting A. baumannii and EfAmi1 from the genome of an Enterococcus faecium prophage region. AbLys1 exhibited substrate preference for bacteria belonging to the species Acinetobacter baumannii, while EfAmi1 showed a wider substrate specificity. The physicochemical and kinetic properties of AbLys1 and EfAmi1 and their antimicrobial activity were investigated against a wide range of both Gram + and Gram - bacteria. Finally, the 3D structures of AbLys1 and EfAmi1 was resolved by X-ray crystallography and studied in detail. The second step included total genomic DNA extraction from marine biofilm, isolated from the industrial zone of Korinthos, Illumina NextSeq500 sequencing and direct search for peptidoglycan hydrolases genes. Bioinformatics analysis of the sequencing data allowed the identification of a glycoside hydrolase, AbLys2, which cloned, expressed and characterized. The enzyme showed substrate preference for Acinetobacter baumannii. The physicochemical and kinetic properties of AbLys2 were investigated, as well as the antimicrobial activity against both Gram + and Gram – bacteria. The second part of the project aimed at finding ways for engineering the substrate specificity and activity of AbLys1. The antimicrobial peptide CLLKKLLKKC (C(LLKK)2C) was fused at the N-terminus of AbLys1. The newly constructed glycoside hydrolase, (art-AbLys1), exhibited expanded and increased activity compared with the wild-type, AbLys1. The enzyme was particular active against Acinetobacter baumannii, ampicillin resistant Enterococcus faecium, Staphylococcus epidermidis (MRSE), Escherichia coli DH5a, compared to AbLys1. Its ability to inhibit bacterial growth is expanded towards Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and Klebsiella oxytoca. The final step was the development of an encapsulation system for art-AbLys1 using sodium alginate particles (art-AbLys1-AlgPs), as a system of stabilization and/or controlled release. The ability of art-AbLys1-AlgPs to inhibit the formation of bacterial biofilms formed by of Acinetobacter baumanni, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and the clinical strain Streptococcus pyogenes was established. Moreover, the results showed that the encapsulation contributed to the improvement of the enzyme stability.

Το φαινόμενο της γενικευμένης πολλαπλής βακτηριακής ανθεκτικότητας, που πλέον παρατηρείται από την εκτεταμένη και ανορθολογική χρήση των αντιβιοτικών θέτουν σε κίνδυνο τα μέχρι τώρα οφέλη τους στο πεδίο της υγείας καθώς το φαινόμενο λαμβάνει διαστάσεις παγκόσμιας κρίσης. Η ανακάλυψη πολλών γνωστών αντιβιοτικών, σχεδόν πάντα συνοδεύτηκε από εκτεταμένη και ανορθολογική χρήση και έπειτα την εμφάνιση βακτηρίων που ανθίστανται στην δράση τους. Το γεγονός ότι πλέον οι μεταδοτικές ασθένειες που οφείλονται σε παθογόνους μικροοργανισμούς δεν μπορούν να θεραπευτούν από τη χρήση των αντιβιοτικών, το καθιστά παγκόσμια απειλή και αποτελεί μείζον ζήτημα της δημόσιας υγείας. Στην συγκεκριμένη μελέτη, επιλέχθηκαν περιπτώσεις εμφάνισης του φιανομένου της πολλαπλής ανθεκτικότητας στα πολυανθεκτικά βακτήρια, τα οποία δύναται να προκαλέσουν επικίνδυνες λοιμώξεις στον άνθρωπο, σε όλο τον κόσμο, λόγω φαινομένων ανθεκτικότητας έναντι των αντιβιοτικών. Η άμεση απειλή για την ανθρώπινη υγεία καθοδηγεί την έρευνα στην ανάπτυξη νέων και καινοτόμων αντιβακτηριακών ενώσεων. Τα λυτικά ένζυμα που προέρχονται από βακτηριοφάγους (ενδολυσίνες ή «ένζυμα-αντιβιοτικά» - «Enzybiotics») και έχουν ως πρωταρχικό ρόλο την υδρόλυση του κυτταρικού τοιχώματος του ξενιστή, παρουσιάζουν εξειδίκευση για το βακτήριο ξενιστή σε επίπεδο γένους, και σε ορισμένες περιπτώσεις έως και το επίπεδο του στελέχους εντός του ίδιου είδους, χαρακτηριστικό που καθιστά τις ενδολυσίνες ως την πιθανή εναλλακτική ή ενισχυτική/πρόσθετη ένωση στα σύγχρονα αντιβιοτικά.Έχοντας σαν απώτερο σκοπό την εύρεση καινοτόμων τρόπων αντιμετώπισης της ανθεκτικότητας επιχειρήθηκε, αρχικά, η έρευνα με έμφαση στα βακτήρια Acinetobacter baumannii και Enterococcus faecium. Το ζητούμενο ήταν η μελέτη της δυνατότητας αντιμετώπισης μέσω των υδρολυτικών ενζύμων Enzybiotics. Αν και η χρήση των συγκεκριμένων ενζύμων είναι ευρέως διαδεδομένη, η διαφοροποίηση έγκειται στην ανακάλυψη νέων ενζυύων με ιδιαίτερα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά, επιλέγοντας ωε πηγές για αναζήτηση λειτουργική γονιδιωματική αλλά και μεταγονιδωματικές βιβλιοθήκες προερχόμενες από ιδιαίτερα περιβάλλοντα βιοποικιλότητας. Ο πρώτος άξονας της μελέτης περιλάμβανε συγκριτική μελέτη δύο υδρολασών της πεπτιδογλυκάνης, της AbLys1 από τον βακτηριοφάγο Acinetobacter phage TZA1 που προσβάλει το Acinetobacter baumannii και της EfAmi1 από ενσωματωμένη μορφή φάγου (προφάγος) στο γονιδίωμα του βακτηρίου Enterococcus faecium. Η AbLys1 εμφάνισε εξειδίκευση ως προς τα βακτήρια του είδους Acinetobacter baumannii ενώ η EfAmi1 παρουσίασε μεγαλύτερο εύρος εκλεκτικότητας. Τα δυο ένζυμα χαρακτηρίστηκαν κινητικά, φυσικοχημικά και μελετήθηκε η αντιμικροβιακή τους δράση έναντι μεγάλου εύρους Gram+ και Gram- βακτηρίων. Τέλος, επιλύθηκε η τρισδιάστατή τους δομή με κρυσταλλογραφία ακτίνων X.Ο δεύτερος άξονας περιλάμβανε απομόνωση του ολικού γονιδιωματικού DNA από θαλάσσιο βιοϋμένιο που απομονώθηκε από τη βιομηχανική περιοχή της Κορίνθου, αλληλούχιση Illumina NextSeq500 και αναζήτηση γονιδίων υδρολασών της πεπτιδογλυκάνης. Η αναζήτηση οδήγησε στην ανακάλυψη μιας γλυκοσιδάσης της πεπτιδογλυκάνης AbLys2, η οποία παρουσιάζει ιδιαίτερα χαρακτηριστικά έκφρασης και εμφανίζει εξειδίκευση ως προς το Acinetobacter baumannii. Το ένζυμο χαρακτηρίστηκεν κινητικά, φυσικοχημικά και μελετήθηκε η αντιμικροβιακή του δράση έναντι μεγάλου εύρους Gram+ και Gram- βακτηρίων.Στο δεύτερο μέρος της μελέτης, πραγματοποιήθηκε σύντηξη του αντιμικροβιακού πεπτιδίου CLLKKLLKKC (C(LLKK)2C) με το N-τελικό άκρο της γλυκοσιδάσης AbLys1, για την δημιουργία ενός τεχνιτού λυτικού ενζύμου μέσω πρωτεϊνικής μηχανικής. Η νέα γλυκοσιδάση, (art-AbLys1) παρουσίασε διευρυμένη εκλεκτικότητα και σημαντικά υψηλότερη δραστικότητα, συγκριτικά με τον άγριο τύπο AbLys1, κυρίως όσον αφορά τα στελέχη Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecium με ανθεκτικότητα στην αμπικιλλίνη, Staphylococcus epidermidis (MRSE), Escherichia coli DH5a έχοντας ικανότητα να αναστέλλει και την ανάπτυξη τους. Ικανότητα αναστολής της ανάπτυξης επιδεικνύει και έναντι των άλλων δύο βακτηρίων, της Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 και Klebsiella oxytoca. Τελικό εγχείρημα της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη ενός ενζυμικού συστήματος για την ενθυλάκωση του ενζύμου art-AbLys1 σε σφαιρίδια πολυμερούς αλγινικού ασβεστίου ως ένα σύστημα σταθεροποίησης ή/και ελεγχόμενης ελευθέρωσης. Το σύστημα που κατασκευάστηκε (art-AbLys1-Alg-Ps) αξιολογήθηκε ως προς την ικανότητα του να αναστέλει επιτυχημένα τον σχηματισμό βιοϋμενίων βακτηρίων A. baumanni, P. aeruginosa ATCC 27853 και του στελέχους S. pyogenes. Επίσης, η ενθυλάκωση ταυτόχρονα αύξησε σημαντικά την σταθερότητα του ενζύμου.