Development of optoacoustic system and methods for biomarker monitoring in the visible and infrared

Abstract

Over the last decades, extensive research has been conducted to develop novel optoacoustic (OA) diagnostic systems for biomedical applications. OA imaging and sensing is a hybrid technique relying on optical excitation and acoustic detection. It is based on the formation of acoustic waves following a material's absorption of intensity-modulated optical radiation. The amplitude of OA waves is directly proportional to the medium's absorption coefficient for the employed excitation wavelength. Therefore, the technique provides molecular specificity based on optical absorption by a material or biological tissue. Optoacoustic imaging and spectroscopy represent one of the most dynamic sectors of biomedical engineering, fostering biomedical research for preclinical and clinical applications. Nevertheless, in most cases, OA setups are bulky, complex, and costly, as they typically require the integration of expensive nanosecond lasers with limited wavelength availability. Therefore, to extend the applicability of OA applications in both preclinical and clinical directions, it is necessary to increase portability, improve multispectral capabilities, and drastically reduce the cost of OA modalities. High-power light-emitting diodes (LED) can facilitate this goal since they come in various wavelengths, are remarkably cost-efficient compared to lasers, and can generate OA signals in tissue-mimicking phantoms or biological tissues. Within this framework, in this study, the spectroscopic potential of high-power LEDs in OA configurations has been systematically investigated, leading to the development of a portable LED-based OA sensing system for quantitative measurements and biomarker monitoring. OA sensing techniques and LEDs’ spectral unmixing potential were evaluated with tissue-mimicking phantoms and in vivo. By employing low-cost and commercially available electronic components, two high-power LED sources, and a single-element piezoelectric ultrasonic transducer for signal detection, the developed prototype has the potential to provide quantitative OA measurements. Initially, the LEDs' performance in pulsed mode operation and their OA generation efficiency were investigated. The performance of the OA sensing system in terms of optical spectral emission and pulse characterization was also evaluated. Furthermore, the system’s spectral unmixing capabilities were explored using gelatin-based tissue-mimicking phantoms demonstrating both optical absorption and scattering properties. Two Series of tissue-mimicking phantom samples were generated using gelatin as a buffer medium, Indian inks as absorption agents, and Intralipid solution to introduce optical scattering. The first tissue-mimicking phantom series (Series I) involved phantoms demonstrating predominant optical absorption properties with negligible scattering. Two different types of Indian inks were added to varying amounts in the gelatin solution to form mixtures of various relative ink concentrations. The second phantom series (Series II) was generated by preparing a gelatin-Intralipid buffer aqueous solution to introduce significant optical scattering. Cylindrical tubes of gelatin-ink mixtures were embedded in the buffer solution to mitigate blood vessels inside scattering tissue media. Series I phantoms were used for a parametric study of the OA response as a function of a) absorber (ink) concentration and b) applied energy fluence in order to evaluate the degree of linearity among the involved physical quantities, as predicted by the standard theoretical treatment of OA effect. Series I and Series II phantom samples were developed to test linear spectral unmixing methodology in optoacoustic measurements. Six different relative ink concentrations were selected to realize the unmixing experiments in each phantom series. The absolute differences from the reference values of the OA spectral unmixing estimations in Series I phantoms ranged from 0.7 to 17 %. In Series II, phantoms exhibiting both optical scattering and absorption properties have been sufficient to determine the relative concentrations of the absorbing inks with absolute differences from the reference values ranging from 0.4 to 12.3 % at maximum. The research findings of the phantom study led to the development of an upgraded portable LED-based OA sensing system capable of monitoring hemodynamic changes and critical biomarkers in vivo. The upgraded system incorporated high-power LEDs that were overdriven and operated in pulsed mode by a custom-developed, inexpensive, printed circuit board (PCB). OA signal detection, amplification, and data acquisition are also based on affordable, custom-developed, or commercially available electronic devices. A specially 3D designed and 3D printed finger probe was utilized for in vivo OA measurements in transmission mode, i.e., light excitation and ultrasound OA detection are on opposite sides of the finger. The system effectively monitored hemodynamic changes and blood microcirculation in human index fingers with high sensitivity and accuracy. Its capability to simultaneously record the amplitude and the detection time of flight of the generated OA signals enables concurrent estimation of essential biomarkers. It is able to monitor in vivo several biomarkers related to hemodynamic changes and tissue vasodilation changes under vascular occlusion conditions. The system was tested in real conditions by engaging eight healthy volunteers in a series of noninvasive measurements on their right hand index fingers. Heart rate pulsation affects the amount of blood in the finger and, consequently, induces a periodical tissue dilation. Heart rate was systematically detected by analyzing OA signal peak detection time of flight (TOF) oscillations due to finger tissue dilation. Heart rate measurements were systematically validated with simultaneous measurements by a medical-grade pulse oximeter. Venous occlusion (VO) challenge tests were utilized to estimate blood flow and finger tissue vasodilation. Blood flow (BF) could be assessed in two different ways. Firstly, the linear OA signal increase rate during venous occlusion was employed to estimate BF in a manner similar to that proposed in other studies. Moreover, BF was calculated using a new methodological approach proposed by this study, which is based on directly estimating the rate of blood volume changes during venous occlusion. The approach utilizes TOF variations and geometrical modeling of the OA-excited part of the finger. This approach allows for modeling the finger’s physical dimensions and monitoring tissue vasodilation during hemodynamic changes. BF calculations based on this approach were in accordance with the physiological blood flow range reported in the literature for human fingers. Furthermore, a linear spectral unmixing methodology was used to calculate the finger’s skin tissue oxygen saturation based on OA measurements. This methodology was utilized to monitor the percentage of oxygen saturation difference %ΔSO2 during hemodynamic changes imposed by venous or arterial occlusion conditions during vascular occlusion tests. In VO tests, oxygen saturation change from the average %SO2 baseline values demonstrated an apparent increase for all volunteers. This increase was promptly succeeded by a rapid decline after the cessation of the occlusion. In arterial occlusion (AO) tests, a decrease in oxygen saturation is observed during occlusion conditions. Oxygen saturation decrease is followed by a rapid increase immediately after the cessation of the occlusion during the so-called reactive hyperemia phase. During AO experiments, recovery slope (RS) and recovery time (RT) commonly used biomarkers related to the reactive hyperemia phase that follows an arterial occlusion challenge test were also estimated. These measurements were consistent with the results presented in previous studies, demonstrating the promising clinical potential of the system for skin microcirculation and vascular assessment. In conclusion, this study presents, for the first time, a compact and inexpensive LED-based OA sensing system for OA spectroscopic in vivo applications. Analysis of the amplitude and the TOF of optoacoustic signals enabled monitoring of essential biomarkers, including heart rate, local oxygen saturation, tissue vasodilation, blood flow, recovery slope, and recovery time of the arterial occlusion reactive hyperemia phase. The system could become a valuable and reliable tool for clinical studies assessing arteriovascular diseases and skin microcirculation. Furthermore, its applicability could be extended to clinical studies to evaluate hemodynamic changes associated with injuries, tissue inflammatory responses, and vasodilator drug assessment.

Τις τελευταίες δεκαετίες, διεξάγεται εκτεταμένη έρευνα η οποία εστιάζει στην ανάπτυξη νέων οπτικοακουστικών (ΟΑ) διαγνωστικών συστημάτων κατάλληλων για βιοϊατρικές εφαρμογές. Η οπτοακουστική απεικόνιση και φασματοσκοπία αποτελεί μια υβριδική τεχνική που βασίζεται στην οπτική διέγερση ιστών και την ακουστική ανίχνευση των παραγόμενων υπερήχων. Ειδικότερα, βασίζεται στην ανίχνευση ακουστικών κυμάτων που δημιουργούνται σε ένα υλικό μετά από την απορρόφηση οπτικής ακτινοβολίας της οποίας η ένταση έχει υποστεί κατάλληλη διαμόρφωση. Το πλάτος των παραγόμενων οπτοακουστικών κυμάτων είναι ευθέως ανάλογο με τον συντελεστή απορρόφησης των συστατικών του ιστού ή του υλικού για το συγκεκριμένο μήκος κύματος οπτικής διέγερσης. Επομένως, η τεχνική παρέχει μοριακή εξειδίκευση που βασίζεται στην οπτική απορρόφηση. Η οπτοακουστική απεικόνιση και η φασματοσκοπία αντιπροσωπεύουν πλέον έναν από τους πιο δυναμικούς τομείς της βιοϊατρικής έρευνας με πλήθος προκλινικών και κλινικών εφαρμογών. Ωστόσο, στις περισσότερες περιπτώσεις, οι οπτοακουστικές διατάξεις είναι ογκώδεις, σύνθετες και ακριβές, καθώς απαιτούν συνήθως την ενσωμάτωση παλμικών λέιζερ νανοδευτερολέπτου με περιορισμένη διαθεσιμότητα σε μήκη κύματος. Επομένως, για να επεκταθεί η δυνατότητα εφαρμογής οπτοακουστικών διατάξεων τόσο σε προκλινική όσο και σε κλινική κατεύθυνση, είναι απαραίτητο να αυξηθεί η φορητότητα, να βελτιωθούν οι πολυφασματικές δυνατότητες και να μειωθεί δραστικά το κόστος των συστημάτων αυτών. Οι δίοδοι εκπομπής φωτός (LED) υψηλής ισχύος μπορούν να διευκολύνουν αυτόν τον στόχο, καθώς είναι εμπορικά διαθέσιμες σε διάφορα μήκη κύματος, είναι αξιοσημείωτα πιο οικονομικές σε σύγκριση με τα λέιζερ και μπορούν να παράγουν οπτοακουστικά σήματα τόσο σε προσομοιώματα όσο και σε πραγματικούς βιολογικούς ιστούς. Σε αυτό το πλαίσιο, σε αυτή τη μελέτη, διερευνήθηκε συστηματικά η δυναμική των LED υψηλής ισχύος για οπτοακουστικές φασματοσκοπικές μετρήσεις με αποτέλεσμα την ανάπτυξη ενός φορητού συστήματος οπτοακουστικής ανίχνευσης βασισμένου σε διόδους LED, το οποίο είναι κατάλληλο για ποσοτικές μετρήσεις και την παρακολούθηση βιοδεικτών in vivo. Οι δυνατότητες του συστήματος αξιολογήθηκαν με φασματοσκοπικές μεθόδους και τεχνικές οπτοακουστικής ανίχνευσης τόσο με την αξιοποίηση προσομοιωμάτων ιστού, όσο και με μετρήσεις in vivo. Χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα και χαμηλού κόστους, ηλεκτρονικά εξαρτήματα, δύο πηγές LED υψηλής ισχύος και έναν πιεζοηλεκτρικό αισθητήρα υπερήχων για την ανίχνευση του οπτοακουστικού σήματος, αναπτύχθηκε οπτοακουστική διάταξη η οποία έχει τη δυνατότητα για ποσοτικές οπτοακουστικές μετρήσεις ακριβείας. Αρχικά, διερευνήθηκε η απόδοση των LED σε παλμική λειτουργία και η δυνατότητα τους για παραγωγή οπτοακουστικών σημάτων. Αξιολογήθηκε επίσης, η οπτική διέγερση του συστήματος όσον αφορά το φασματικός εύρος εκπομπής των LED και τη μορφή των οπτικών παλμών. Στη συνέχεια, διερευνήθηκαν με συστηματικό τρόπο οι φασματoσκοπικές δυνατότητες του συστήματος αξιοποιώντας προσομοιώματα ιστού με βάση υδατικά διαλύματα ζελατίνης, τα οποία επιδεικνύουν τόσο οπτική απορρόφηση όσο και ιδιότητες σκέδασης. Πιο συγκεκριμένα, δημιουργήθηκαν δύο σειρές δειγμάτων χρησιμοποιώντας διάλυμα ζελατίνης ως διαλύτη, σινική μελάνη ως παράγοντα απορρόφησης και διάλυμα Intralipid για την εισαγωγή οπτικής σκέδασης. Η πρώτη σειρά προσομοιωμάτων (Σειρά I) περιλάμβανε δείγματα που παρουσίαζαν σημαντική οπτική απορρόφηση και αμελητέα σκέδαση. Στα δείγματα της Σειράς Ι, δύο διαφορετικοί τύποι σινικής μελάνης προστίθενται με διάφορες αναλογίες στο διάλυμα ζελατίνης για να σχηματιστούν μίγματα διαφορετικών σχετικών συγκεντρώσεων μελανιών. Η δεύτερη σειρά προσομοιωμάτων (Σειρά II) δημιουργήθηκε με την παρασκευή ενός υδατικού διαλύματος βάσης μίγματος ζελατίνης-Intralipid για την εισαγωγή ιδιοτήτων οπτικής σκέδασης. Έπειτα, κυλινδρικά σωληνάρια μιγμάτων ζελατίνης-μελάνης ενσωματώθηκαν στο διάλυμα ζελατίνης-Intralipid με σκοπό να προσομοιώσουν δομές αιμοφόρων αγγείων των ιστών. Αρχικά, τα προσομοιώματα της Σειράς Ι χρησιμοποιήθηκαν για μια παραμετρική μελέτη της οπτοακουστικής απόκρισης του συστήματος σε συνάρτηση με τη α) συγκέντρωση απορροφητή (μελάνης) και β) της προσπίπτουσας οπτικής ροής ενέργειας. Στόχος ήταν η αξιολόγηση του βαθμού γραμμικής συσχέτισης μεταξύ των παραπάνω φυσικών μεγεθών και του πλάτους του οπτοακουστικού σήματος όπως προβλέπεται και από το βασικό θεωρητικό μοντέλο της δημιουργίας οπτοακουστικών σημάτων. Στη συνέχεια, διερευνήθηκαν συστηματικά οι φασματοσκοπικές δυνατότητες των LED αξιοποιώντας τα παραπάνω είδη προσομοιωμάτων ιστού. Για το σκοπό αυτό δημιουργήθηκαν και μελετήθηκαν δείγματα της σειράς I και της σειράς II με έξι διαφορετικές σχετικές συγκεντρώσεις μιγμάτων μελανιών και εφαρμόστηκε η μέθοδος της γραμμικής οπτοακουστικής φασματοσκοπικής ανάλυσης (linear spectral unmixing) για τον πειραματικό προσδιορισμό των ποσοστιαίων συγκεντρώσεων των μελανιών στα δείγματα. Η απόκλιση των οπτοακουστικών φασματοσκοπικών μετρήσεων στα προσομοιώματα της Σειράς Ι κυμάνθηκε μεταξύ 0,7 έως 17 % σε σχέση με τις τιμές αναφοράς. Στη Σειρά II με τα προσομοιώματα που είχαν και ιδιότητες οπτικής σκέδασης εκτός από ιδιότητες απορρόφησης, η απόκλιση των οπτοακουστικών φασματοσκοπικών μετρήσεων σε σχέση με τις τιμές αναφοράς κυμάνθηκε από 0,4 έως 12,3 %. Τα ερευνητικά ευρήματα της πρώτης φάσης της μελέτης με τα προσομοιώματα ιστών οδήγησαν στην ανάπτυξη ενός αναβαθμισμένου φορητού συστήματος οπτοακουστικής ανίχνευσης LED το οποίο έχει τη δυνατότητα να παρακολουθεί αιμοδυναμικές μεταβολές και σημαντικούς βιοδείκτες in vivo. Το αναβαθμισμένο σύστημα ενσωμάτωσε διόδους LED υψηλής ισχύος που υπερτροφοδοτούνται και λειτουργούν παλμικά, οδηγούμενες από ειδικά σχεδιασμένη ηλεκτρονική πλακέτα (PCB) που αναπτύχθηκε για το σκοπό αυτό. Η ανίχνευση των οπτοακουστικών σημάτων, η ενίσχυση τους και η ηλεκτρονική τους καταγραφή, βασίζονται επίσης σε ειδικά σχεδιασμένες ή εμπορικά διαθέσιμες, χαμηλού κόστους, ηλεκτρονικές συσκευές. Επιπρόσθετα, σχεδιάστηκε και εκτυπώθηκε τρισδιάστατα, προσαρμογέας που τοποθετείται σε δάχτυλα, στον οποίο προσαρμόζονται κατάλληλα οι δίοδοι LED και ο ανιχνευτής υπερήχων. Με τον προσαρμογέα αυτόν, είναι εφικτές οπτοακουστικές μετρήσεις in vivo σε «λειτουργία διάδοσης» (transmission mode), όπου η οπτική διέγερση του ιστού και η ανίχνευση των υπερήχων γίνονται αντιδιαμετρικά στις πλευρές του δακτύλου. Το αναβαθμισμένο σύστημα έχει τη δυνατότητα να καταγράψει αιμοδυναμικές μεταβολές και να παρακολουθήσει τη μικροκυκλοφορία του αίματος στα δάκτυλα με υψηλή ευαισθησία και ακρίβεια. Η ικανότητά του να καταγράφει ταυτόχρονα το πλάτος των παραγόμενων οπτοακουστικών σημάτων αλλά και το απαιτούμενο χρονικό διάστημα για την ανίχνευση τους, επιτρέπει την ταυτόχρονη παρακολούθηση βασικών βιοδεικτών in vivo. Το σύστημα έχει τη δυνατότητα να παρακολουθεί βιοδείκτες που σχετίζονται με αιμοδυναμικές μεταβολές και να καταγράφει την αγγειοδιαστολή των δακτύλων υπό συνθήκες αγγειακής απόφραξης. Οι δυνατότητες του συστήματος δοκιμάστηκαν σε πραγματικές συνθήκες από οκτώ υγιείς εθελοντές σε μια σειρά μη επεμβατικών μετρήσεων στους δείκτες των δεξιών χεριών τους. Η παλμική κίνηση της καρδιάς επηρεάζει την ποσότητα του αίματος στα δάχτυλα και κατά συνέπεια προκαλεί την περιοδική διαστολή τους. Ο καρδιακός ρυθμός ανιχνεύτηκε συστηματικά αναλύοντας τις ταλαντώσεις του χρόνου ανίχνευσης (TOF) των οπτοακουστικών σημάτων λόγω της περιοδικής διαστολής του ιστού των δακτύλων. Οι μετρήσεις του καρδιακού ρυθμού επικυρώθηκαν συστηματικά με ταυτόχρονες μετρήσεις από παλμικό οξύμετρο ιατρικής πιστοποίησης. Επιπρόσθετα, υλοποιήθηκαν τεστ πρόκλησης φλεβικής απόφραξης (VO) για την εκτίμηση της ροής του αίματος και τη μελέτη της αγγειοδιαστολής των δακτύλων. Το σύστημα είναι δυνατόν να εκτιμήσει την ροή του αίματος (BF) στα δάχτυλα με δύο διαφορετικούς τρόπους. Ο πρώτος τρόπος είναι μέσω του γραμμικού ρυθμού αύξησης (κλίση) του οπτοακουστικού σήματος σε συνάρτηση με το χρόνο κατά τη διάρκεια της φλεβικής απόφραξης ακολουθώντας μεθοδολογία όπως προτείνεται και σε άλλες μελέτες φλεβικής απόφραξης. Επιπλέον, η ροή του αίματος στα δάχτυλα υπολογίστηκε αξιοποιώντας μια νέα μεθοδολογική προσέγγιση που προτείνεται από αυτήν εδώ τη μελέτη και η οποία βασίζεται στην εκτίμηση του σχετικού ρυθμού μεταβολής του όγκου του αίματος μέσω της παρατηρούμενης αγγειοδιαστολής στο δάχτυλο κατά τη διάρκεια της φλεβικής απόφραξης. Η μέθοδος βασίζεται στις μεταβολές του χρόνου ανίχνευσης των οπτοακουστικών σημάτων και στη γεωμετρική μοντελοποίηση του τμήματος του δακτύλου που διεγείρεται οπτοακουστικά. Αυτή η προσέγγιση επιτρέπει την εκτίμηση των μεταβολών των φυσικών διαστάσεων του δακτύλου μέσω της παρακολούθησης της αγγειοδιαστολής κατά τη διάρκεια των αιμοδυναμικών μεταβολών λόγω της φλεβικής απόφραξης. Οι τιμές της ροής του αίματος που προκύπτουν με την προτεινόμενη μεθοδολογία είναι αντίστοιχες με το εύρος τιμών της ροής του αίματος στα ανθρώπινα δάχτυλα όπως αναφέρεται στη διεθνή βιβλιογραφία. Ο κορεσμός του οξυγόνου στο δέρμα εκτιμήθηκε με τη μέθοδο της γραμμικής οπτοακουστικής φασματοσκοπικής ανάλυσης αξιοποιώντας μετρήσεις του πλάτους των οπτοακουστικών σημάτων. Με τη μεθοδολογία αυτή μελετήθηκε η ποσοστιαία μεταβολή στον κορεσμό του οξυγόνου %ΔSO2 κατά τις αιμοδυναμικές αλλαγές που επιβάλλονται από τις συνθήκες φλεβικής ή αρτηριακής απόφραξης κατά τη διάρκεια των αντίστοιχων τεστ. Στα τεστ φλεβικής απόφραξης, παρουσιάστηκε θετική ποσοστιαία μεταβολή του κορεσμού του οξυγόνου από τις μέσες τιμές βάσης %SO2 για όλους τους εθελοντές. Αυτή η αύξηση στον κορεσμό του οξυγόνου ακολουθείται από μια ταχεία μείωση αμέσως μετά τη διακοπή της φλεβικής απόφραξης. Στα τεστ αρτηριακής απόφραξης, παρατηρείται μείωση του κορεσμού οξυγόνου κατά τις συνθήκες απόφραξης. Η μείωση του κορεσμού οξυγόνου ακολουθείται από μια ταχεία αύξηση αμέσως μετά το πέρας της αρτηριακής απόφραξης κατά τη διάρκεια της λεγόμενης φάσης αντιδραστικής υπεραιμίας (reactive hyperemia phase). Με βάση τις παρατηρήσεις κατά τη διάρκεια των πειραμάτων αρτηριακής απόφραξης, κατέστη δυνατόν να εκτιμηθούν οι βιοδείκτες της κλίσης ανάκτησης (recovery slope, RS) και του χρόνου ανάκτησης (recovery time, RT), που σχετίζονται με τη φάση της αντιδραστικής υπεραιμίας. Όπως και στις προηγούμενες περιπτώσεις, οι μετρήσεις ήταν συνεπείς με τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται σε προηγούμενες μελέτες στη διεθνή βιβλιογραφία αποδεικνύοντας έτσι τις πολλά υποσχόμενες κλινικές δυνατότητες του συστήματος για την παρακολούθηση βιοδεικτών που σχετίζονται με την αγγειακή μικροκυκλοφορία του δέρματος και την αγγειοδιαστολή. Συμπερασματικά, σε αυτή τη μελέτη, παρουσιάζεται για πρώτη φορά, ένα φορητό και χαμηλού κόστους σύστημα οπτοακουστικής ανίχνευσης βασισμένο σε διόδους LED. Το σύστημα είναι κατάλληλο για οπτοακουστικές και φασματοσκοπικές μετρήσεις in vivo. Η ταυτόχρονη καταγραφή και η ανάλυση των τιμών του πλάτους και του χρόνου ανίχνευσης των οπτοακουστικών σημάτων επιτρέπει την παρακολούθηση in vivo βασικών βιοδεικτών όπως είναι ο καρδιακός ρυθμος, ο κορεσμός του οξυγόνου στο δέρμα, η αγγειοδιαστολή, η ροή του αίματος στα δάχτυλα, αλλά και η κλίση ανάκτησης RS και ο χρόνος ανάκτησης RT της φάσης αντιδραστικής υπεραιμίας κατά τη διάρκεια τεστ αρτηριακής απόφραξης. Το σύστημα έχει τη δυνατότητα να αποτελέσει ένα πολύτιμο και αξιόπιστο εργαλείο για κλινικές μελέτες που σχετίζονται με την αξιολόγηση περιφερειακών αγγειακών παθήσεων και της μικροκυκλοφορίας του δέρματος. Επιπλέον, η δυνατότητα αξιοποίησης του θα μπορούσε να επεκταθεί σε κλινικές μελέτες για την αξιολόγηση αιμοδυναμικών μεταβολών που σχετίζονται με τραυματισμούς, φλεγμονώδεις αποκρίσεις του ιστού και αξιολόγηση αγγειοδιασταλτικών φαρμάκων.