Study of two badnaviruses infecting grapevine in Greece

Abstract

Grapevine is a highly unique and globally cultivated horticultural crop, and one of the most susceptible crops to viruses, with over 95 virus species having been identified so far. In this thesis, the presence of two badnaviruses (GRLDaV, GBV-1) as well as their incidence, their genetic diversity, their distribution within the affected vines throughout the year, mealybug transmission and electron microscopy were investigated. GRLDaV was identified mainly in autochthonous grapevine varieties, and it showed a higher frequency in the self-rooted varieties, especially in the geographic region of the Cyclades Islands. GBV-1 was detected in 4 geographic regions and it was most frequent in the grafted indigenous varieties. In addition, ten complete genome sequences of GRLDaV isolates were retrieved by HTS and subjected to comparative sequence analysis along with other published complete sequences of the virus. High levels of sequence divergence were observed, especially among the GRLDaV isolates from Greece. On the other hand, four complete genomes of GBV-1 isolates obtained from Greek vineyards displayed a high level of sequence identity among them, and they were distinct from the Croatian isolate sequence, the only full genome GBV-1 sequence available until recently. Further phylogenetic analysis indicated the diversification of GRLDaV isolates into three separate clades, while the isolates of GBV-1 clustered into two groups based on their geographic origin. The distribution of the two viruses in different plant tissues throughout dormancy and vegetative season was also studied. For this purpose, three grapevines positive for both viruses were tested throughout the years 2020-2021. The two viruses were consistently detected by PCR in the tested vines during the different seasons from September 2020 to December 2021. The viruses were present in leaves, petioles, canes, and grapes indicating that all these types of tissue can be used for their reliable detection using the herein-developed PCR assays. Lastly, in this study, the capacity of the mealybug Planococcus ficus (Signoret), a known vector of many viruses including the badnavirus GBV-1, to transmit GRLDaV was tested. The virus was transmitted to healthy vines of cv. ‘Vidiano’ with an efficiency of 14.3% (3/21 vines) indicating that this mode of transmission could also play a role on its spread in the field. Electron microscopy conducted on a grapevine infected with GRLDaV, revealed the presence of bacilliform morphology of its virions, thereby providing further confirmation of its episomal infection.

Η άμπελος είναι ένα ιδιαίτερο και μοναδικό φυτό το οποίο καλλιεργείται παγκοσμίως και στο οποίο έχουν ταυτοποιηθεί πάνω από 95 είδη ιών μέχρι στιγμής. Σε αυτή τη διατριβή, ερευνήθηκε η παρουσία και η συχνότητα δύο ιών του γένους Badnaviru [του ιού που σχετίζεται με τον μεταχρωματισμό των φύλλων της ποικιλίας Ροδίτη (GRLDaV) και του ιού 1 της αμπέλου του γένους Badnavirus (GBV-1)], καθώς και η γενετική τους παραλλακτικότητα και η κατανομή τους μέσα σε μολυσμένα φυτά αμπέλου καθ' όλη τη διάρκεια του έτους. Τέλος μελετήθηκε ο GRLDaV με την χρήση της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας και διερευνήθηκε η μετάδοση του από ψευδόκοκκους. Συμπερασματικά ο GRLDaV ανιχνεύθηκε κυρίως σε αυτόχθονες ποικιλίες αμπέλου και εμφάνισε υψηλότερη συχνότητα στις αυτόριζες ποικιλίες, ειδικά στη γεωγραφική περιοχή των Κυκλάδων. Ο GBV-1 ανιχνεύθηκε κυρίως σε εμβολιασμένες γηγενείς ποικιλίες σε αμπελώνες από 4 γεωγραφικές περιοχές. Δέκα αλληλουχίες πλήρους γονιδιώματος απομονώσεων του GRLDaV ανακτήθηκαν μέσω HTS. Παρατηρήθηκαν υψηλά επίπεδα διαφοροποίησης ιδιαίτερα μεταξύ των απομονώσεων του GRLDaV από την Ελλάδα. Στη περίπτωση του GBV-1 τέσσερις αλληλουχίες πλήρους γονιδιώματος που αποκτήθηκαν από ελληνικές ποικιλίες αμπέλου έδειξαν υψηλό επίπεδο ταυτότητας των αλληλουχιών μεταξύ τους και ήταν διαφοροποιημένες από την απομόνωση της Κροατίας, την μόνη διαθέσιμη διεθνώς πλήρη αλληλουχία γονιδιώματος του GBV-1, μέχρι πρόσφατα. Επιπλέον η περαιτέρω φυλογενετική ανάλυση κατέδειξε τη διαφοροποίηση των απομονώσεων του GRLDaV σε τρεις ξεχωριστούς κλάδους, ενώ οι απομονώσεις του GBV-1 ομαδοποιήθηκαν σε δύο ομάδες με βάση τη γεωγραφική τους προέλευση. Μελετήθηκε επίσης η κατανομή των δύο ιών σε διαφορετικούς φυτικούς ιστούς κατά τη διάρκεια της χειμερινής και της βλαστικής περιόδου, τρία πρέμνα μολυσμένα και με τους δύο ιούς ελέγχθηκαν κατά τη διάρκεια των ετών 2020-2021. Οι δύο ιοί ανιχνεύθηκαν με PCR από τον Σεπτέμβριο του 2020 έως τον Δεκέμβριο του 2021. Οι ιοί ανιχνεύθηκαν σε φύλλα με μίσχους, κληματίδες και ράγες σταφυλιών. Τέλος, σε αυτή τη μελέτη, εξετάστηκε η ικανότητα του ψευδόκοκκου Planococcus ficus (Signoret), γνωστού φορέα πολλών ιών συμπεριλαμβανομένου του GBV-1, να μεταδίδει τον GRLDaV. Ο ιός μεταδόθηκε σε υγιή πρέμνα της ποικιλίας Vidiano με αποτελεσματικότητα 14,3% (3/21 φυτά αμπέλου) υποδεικνύοντας ότι αυτός ο τρόπος μετάδοσης θα μπορούσε επίσης να διαδραματίσει ρόλο στη διάδοσή του στους αμπελώνες. Η ηλεκτρονική μικροσκοπία που διεξήχθη σε πρέμνο μολυσμένο με τον GRLDaV, αποκάλυψε την παρουσία βακιλλόμορφων ιοσωματίων, παρέχοντας έτσι περαιτέρω επιβεβαίωση της ενεργού του μόλυνσης.