Characterisation of the immuno-inflammatory response following operative adolescent idiopathic scoliosis and biological properties of osteoprogenitor cells harvested from vertebral bodies compared to iliac crest

Abstract

In patients undergoing adolescent idiopathic scoliosis (AIS) surgery the yield and differentiation capacities of mesenchymal stem cells (MSCs) from vertebral body (VB) and iliac crest (IC) bone marrow (BM) were investigated comparing the effectiveness of two MSC-harvesting procedures [density gradient centrifugation (Lymphoprep, LMP) and red cell lysis (Ammonium Chloride, AC)]. The burden of surgery of 3 surgical approaches (posterior, posterior-costoplasty, antero-posterior), for AIS correction was also quantified. In 18 patients 10ml of BM were aspirated intraoperatively from IC and VB and MSCs were isolated using AC and LMP harvesting procedures. MSCs were enumerated and phenotypically characterised using colony-forming-unit-fibroblast (CFU-F), flow cytometry and trilineage differentiation assays. For the immuno-inflammatory study 23 patients were recruited. ELISA-assays were performed on serum from 4ml of peripheral blood, at 6 peri-operative time-points (T), measuring 4 cytokines [(Interleukin) IL-6, IL-10, IL-18 and Procalcitonin (PCT)]. Surgical parameters and gender variability were also analysed. Both IC and VB exhibited similar concentrations of MSCs, however AC yielded significantly more MSC/ml by 1.8-fold (IC, p=0.012) and 1.5-fold (VB, p=0.043), compared to LMP. Calcium and glycosaminoglycan (GAG) concentrations were both significantly higher from VB MSCs, compared to IC [Calcium: AC 8.7-fold (p=0.001), LMP 1.2-fold, GAG: AC 3.8-fold (p=0.0005), LMP 1.9-fold (p=0.003)]. Adipogenesis did not show significant differences. VB AC-harvested MSCs presented a significantly smaller colony area by 1.9-fold (p=0.039), compared to IC AC. The post-operative concentrations of IL-6 and IL-10 were always significatintly elevated at T2 and T3 points, in all 3 approaches (p<0.01) with antero-posterior approach presenting the highest levels followed by posterior-costoplasty and posterior approaches. Although prolonged procedures and gender type affected cytokine concentrations, their levels were not statistically significant. In summary, AC isolated more effectively MSCs, without affecting their function. VBBM MSCs demonstrated higher osteo- and chondro-genic differentiation capacities, representing a valid source of MSCs in spinal surgery. The surgical stress reaction quantified with immune-inflammatory markers, was higher in more aggressive and extensile procedures, suggesting greater vigilance in identifying and preventing complications.

Σε ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση εφηβικής ιδιοπαθούς σκολίωσης (AIS), η απόδοση και οι ικανότητες διαφοροποίησης των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων (MSCs) από το σπονδυλικό σώμα (VB) και την λαγόνια ακρολοφία (IC) μυελού των οστών (BM) διερευνήθηκαν συγκρίνοντας την αποτελεσματικότητα δύο διαδικασιών συλλογής MSC [Φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας (Lymphoprep, LMP) και λύση ερυθρών αιμοσφαιρίων (χλωριούχο αμμώνιο, AC)]. Επίσης ποσοτικοποιήθηκε η επιβάρυνση της χειρουργικής επέμβασης 3 χειρουργικών προσεγγίσεων (οπίσθια, οπίσθια-κοστοπλαστική, προσθιο-οπίσθια), για διόρθωση AIS.Σε 18 ασθενείς αναρροφήθηκαν 10 ml BM διεγχειρητικά από IC και VB και τα MSCs απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας διαδικασίες συλλογής AC και LMP. Τα MSC απαριθμήθηκαν και φαινοτυπικά χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας ινοβλάστες μονάδας σχηματισμού αποικίας (CFU-F), κυτταρομετρία ροής και προσδιορισμούς διαφοροποίησης τριών γενεών. Για την ανοσοφλεγμονώδη μελέτη επιλέχθηκαν 23 ασθενείς. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες ELISA σε ορό από 4 ml περιφερικού αίματος, σε 6 περιεγχειρητικά χρονικά σημεία (Τ), μετρώντας 4 κυτοκίνες [(Ιντερλευκίνη) IL-6, IL-10, IL-18 και Προκαλσιτονίνη (PCT)]. Αναλύθηκαν επίσης οι χειρουργικές παράμετροι και η μεταβλητότητα του φύλου. Τόσο το IC όσο και το VB παρουσίασαν παρόμοιες συγκεντρώσεις MSC, ωστόσο το AC απέδωσε σημαντικά περισσότερα MSC/ml κατά 1,8 φορές (IC, p=0,012) και 1,5 φορές (VB, p=0,043), σε σύγκριση με το LMP. Οι συγκεντρώσεις ασβεστίου και γλυκοζαμινογλυκάνης (GAG) ήταν και οι δύο σημαντικά υψηλότερες από τα VB MSCs, σε σύγκριση με το IC [Ασβέστιο: AC 8,7 φορές (p=0,001), LMP 1,2 φορές, GAG: AC 3,8 φορές (p=0,0005), LMP 1,9 -δίπλωμα (p=0,003)]. Η λιπογένεση δεν έδειξε σημαντικές διαφορές. Τα MSC που συλλέχθηκαν από VB AC παρουσίασαν σημαντικά μικρότερη περιοχή αποικίας κατά 1,9 φορές (p=0,039), σε σύγκριση με το IC AC. Οι μετεγχειρητικές συγκεντρώσεις της IL-6 και της IL-10 ήταν πάντα σημαντικά αυξημένες στα σημεία Τ2 και Τ3, και στις 3 προσεγγίσεις (p<0,01) με την προσθιο-οπίσθια προσέγγιση να παρουσιάζει τα υψηλότερα επίπεδα ακολουθούμενη από οπίσθια-κοστοπλαστική και οπίσθια προσεγγίσεις. Αν και οι παρατεταμένες διαδικασίες και ο τύπος φύλου επηρέασαν τις συγκεντρώσεις κυτοκίνης, τα επίπεδά τους δεν ήταν στατιστικά σημαντικά.Συνοπτικά, το AC απομόνωσε πιο αποτελεσματικά τα MSC, χωρίς να επηρεάσει τη λειτουργία τους. Τα MSCs VBBM επέδειξαν υψηλότερες ικανότητες οστεο- και χονδρογονικής διαφοροποίησης, αντιπροσωπεύοντας μια έγκυρη πηγή MSCs στη χειρουργική της σπονδυλικής στήλης. Η χειρουργική αντίδραση στρες που ποσοτικοποιήθηκε με ανοσο-φλεγμονώδεις δείκτες, ήταν υψηλότερη σε πιο επιθετικές και εκτεταμένες επεμβάσεις, υποδηλώνοντας μεγαλύτερη επαγρύπνηση στον εντοπισμό και την πρόληψη των επιπλοκών.