Dynamic changes in chemotactic and metabolic properties in tumor cells undergoing TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT)

Abstract

Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) is a process linked to several hallmarks of cancer including metabolic switching, inflammation, and chemotactic properties. Tumor cells that undergo EMT lose epithelial characteristics like cell-cell adhesion and apical basal polarity and gain expression of mesenchymal proteins including intermediate filaments and various cell surface receptors. As a result, they acquire invasive and metastatic properties. Inflammatory cytokines overexpressed in tumor microenvironment, like Transcription Growth Factor beta 1 (TGF-β1), can induce EMT and is linked to invasion and lymph metastasis in breast cancer. However, the mechanisms of how TGF-β1 promotes invasion and lymph metastasis are not clear. The overall aim of this thesis was to study the role of TGF-β1-induced EMT in regulating metabolic activities and chemotactic properties of breast cancer cells. In Paper I, we investigated changes in glucose metabolism linked to TGF-β1-induced EMT. The results showed a link between reduction of the glucose transporter Glut1 and the anti-proliferative response of TGF-β1. They also showed that re-expression of Glut1 in breast cancer cells during chronic exposure to TGF-β1 allowed them to proliferate and develop a stable EMT on the same time. In Paper II, we demonstrate that TGF-β1-induced EMT is linked to translocation of the protein Syndecan-1 from the cell nucleus to the cell surface. In Paper III, we developed a new invasion method that enabled identification of chemotactic properties of breast cancer cells undergoing TGF-β1-induced EMT. The method involved using a cloning cylinder in the inner parts of the cell culture inserts, which eliminated problems with edge effects, and resulted in significantly improved reproducibility in the invasion assays. Using this method, we identified interleukin 7 (IL-7) and interleukin 15 (IL15) as novel chemotactic factors for EMT cells. In Paper IV, we studied whether TGF-β1 could promote lymph metastasis by promoting the production and secretion of factors that could function as chemo-attractants for breast cancer cells with EMT properties. Results from RNA-sequencing analysis showed the induction of an inflammatory cluster of genes in in lymphatic endothelial cells upon exposure to TGF-β1. Further analysis led to the identification of a number of pairs of chemokines induced by TGFβ1 in lymphatic endothelial cells and corresponding receptors specifically overexpressed in breast cancer cells with EMT properties. In conclusion, the results presented in this thesis provide new insights into the capacity of TGFβ1-induced EMT to promote invasion of breast cancer cells by changing their metabolic activities and the intracellular localization of syndecan-1. The results also indicate that TGFβ1 plays dual roles in lymph metastasis by both promoting chemotactic properties of breast cancer cells and by inducing the expression of chemotactic factors in lymphatic endothelial cells. The results may lead to the development of new diagnostic tools and novel treatment strategies for cancer patients.

Η επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση (EMT) είναι μια διαδικασία που συνδέεται με πολλά χαρακτηριστικά του καρκίνου συμπεριλαμβανομένης της μεταβολικής αλλαγής, της φλεγμονής και των χημειοτακτικών ιδιοτήτων. Καρκινικά κύτταρα που υποβάλλονται σε EMT χάνουν επιθηλιακά χαρακτηριστικά όπως προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου και κορυφαία βασική πολικότητα και αποκτούν έκφραση μεσεγχυματικών πρωτεϊνών συμπεριλαμβανομένων των ενδιάμεσων νηματίων και διαφόρων κυττάρων επιφανειακών υποδοχέων. Ως αποτέλεσμα, αποκτούν επεμβατικές και μεταστατικές ιδιότητες. Φλεγμονώδεις κυτοκίνες που υπερεκφράζονται στο μικροπεριβάλλον του όγκου, όπως ο αυξητικός παράγοντας μεταγραφής βήτα 1(TGF-β1), μπορεί να προκαλέσει EMT και συνδέεται με εισβολή και λεμφική μετάσταση στον καρκίνο του μαστού. Ωστόσο, οι μηχανισμοί για το πώς ο TGF-β1 προάγει την εισβολή και τη λεμφική μετάσταση δεν είναι σαφείς. Ο γενικός στόχος αυτής της διατριβής ήταν να μελετήσει τον ρόλο της επαγόμενης από τον TGF-β1 EMT ρύθμιση των μεταβολικών δραστηριοτήτων και χημειοτακτικών ιδιοτήτων των καρκινικών κυττάρων του μαστού. Στο Paper I, εμείς διερευνήσαμε αλλαγές στο μεταβολισμό της γλυκόζης που συνδέονται με την επαγόμενη από τον TGF-β1 EMT ρύθμιση. Τα αποτελέσματα έδειξαν σύνδεση μεταξύ της μείωσης του μεταφορέα γλυκόζης Glut1 και της αντιπολλαπλασιαστικής απόκρισης του TGF-β1. Έδειξαν επίσης ότι η επανέκφραση της Glut1 στα καρκινικά κύτταρα του μαστού κατά τη διάρκεια της χρόνιας έκθεσης στον TGF-β1 τους επέτρεψε να πολλαπλασιαστούν και να αναπτύξουν ένα σταθερό EMT στον ίδιο χρόνο. Στο Paper II, αποδεικνύουμε ότι η επαγόμενη από τον TGF-β1 EMT συνδέεται με τη μετατόπιση της πρωτεΐνης Syndecan-1 από τον πυρήνα του κυττάρου στην κυτταρική επιφάνεια. Στο Paper III, αναπτύξαμε μια νέα μέθοδο εισβολής που επέτρεψε την ταυτοποίηση των χημειοτακτικών ιδιοτήτων των καρκινικών κυττάρων του μαστού που υποβάλλονται σε ΕΜΤ που προκαλείται από τον TGF-β1. Η μέθοδος περιλάμβανε τη χρήση ενός κυλίνδρου κλωνοποίησης στο εσωτερικό μέρος των ενθέτων κυτταροκαλλιέργειας, τα οποία εξάλειψαν προβλήματα του edge effect και είχαν ως αποτέλεσμα να βελτιωθεί σημαντικά η αναπαραγωγικότητα στις μεθόδους invasion. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, εντοπίσαμε την ιντερλευκίνη 7 (IL-7) και την ιντερλευκίνη 15 (IL15) ως νέους χημειοτακτικούς παράγοντες για κύτταρα ΕΜΤ. Στο Paper IV, μελετήσαμε εάν ο TGF-β1 θα μπορούσε να προάγει τη λεμφική μετάσταση προάγοντας την παραγωγή και έκκριση παραγόντων που θα μπορούσαν να λειτουργήσουν ως χημειο-ελκυστικοί για κύτταρα καρκίνου του μαστού με ιδιότητες EMT. Τα αποτελέσματα από την ανάλυση αλληλουχίας RNA έδειξαν την επαγωγή ενός φλεγμονώδους συμπλέγματος γονιδίων σε λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα κατά την έκθεση στον TGF-β1. Περαιτέρω ανάλυση οδήγησε στην ταυτοποίηση ενός αριθμού ζευγών χημειοκινών που προκαλούνται από τον TGFβ1 σε λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα και αντίστοιχους υποδοχείς που υπερεκφράζονται ειδικά σε καρκινικά κύτταρα του μαστού με ιδιότητες EMT. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται σε αυτή τη διατριβή παρέχουν νέες ιδέες για την ικανότητα του TGFβ1 ΕΜΤ για την προώθηση της εισβολής στα καρκινικά κύτταρα του μαστού αλλάζοντας τις μεταβολικές τους δραστηριότητες και τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό του syndecan-1. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν επίσης ότι ο TGFβ1 παίζει διπλό ρόλο στη λεμφική μετάσταση προάγοντας και τις δύο χημειοτακτικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων του μαστού και με την πρόκληση της έκφρασης χημειοτακτικών παραγόντων στα λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα. Τα αποτελέσματα μπορεί να οδηγήσουν στην ανάπτυξη νέων διαγνωστικών εργαλείων και νέων στρατηγικών θεραπειών για καρκινοπαθείς.