Μελέτη των διαταραχών των φυσικών αναστολέων της πήξης, του αντιγόνου von Willebrand και της πρωτεΐνης ADAMTS-13 σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά με λοιμώξεις και συγγενείς καρδιοπάθειες

Abstract

Introduction: Developmental hemostasis represents a well-known entity, encompassing the delicate discrepancies of the coagulation profile between neonates, older children and adults and the evolving maturation of hemostatic mechanism throughout childhood. Particular prothrombotic and antithrombotic factors are measured at lower levels in neonatal plasma, while other coagulation factors, mainly FVIII and VWF are elevated. Recently, great concern has arised about the role of ADAMTS-13 protein, the VWF cleaving protein in neonatal hemostasis, in health and disease. Despite the underlying differentiation, the coagulation process in neonates is balanced, thus healthy, full-term neonates do not have an increased risk either for hemorrhage or thrombosis. However, the delicate balance is easily deranged in hospitalized neonates due to prematurity, infection, perinatal stress, central catheter placement etc. Early or late onset sepsis is one of the most common complications in Neonatal Intensive Care Units (NICUs), increasing substantially morbidity and mortality. Inflammation activates the coagulation cascade and vice versa and this interplay is described by the term “immunothrombosis” or “thromboinflammation”. Immunothrombosis represents an inherent defending mechanism, however overactivation results in major, even lifethreatening complications. What is more, congenital heart defects are accompanied also by considerable alterations of the hemostatic process. The underlying pathophysiologic mechanism is multifactorial and includes liver dysfunction, secondary erythrocytosis, hypoxia etc. Furthermore, coagulation abnormalities are associated with poor prognosis in CHD, while thromboembolic complications may present many years after surgical correction. Aim: Aim of the present study was the investigation of coagulation profile, particularly clotting, anticlotting factors and ADAMTS-13 protein in preterm and term neonates with early or late sepsis, as well as congenital heart disease. Materials and methods: The infection group includes 16 premature and fullterm septic neonates and the CHD group includes 20 neonates with cyanotic or non-cyanotic heart defect. The control group includes 18 healthy neonates. Infection group: Coagulation parameters were measured initially in the acute phase of infection and secondly after recovery. The diagnosis of infection was based on clinical signs and symptoms, raised inflammatory markers and/or positive blood culture and antibiotic treatment for at least 10 days. Positive culture of blood or other normally sterile fluid was not a prerequisite for infection diagnosis due to occasional previous antibiotic administration either to mother or baby. The disease severity was assessed by nSOFA score. CHD group: The investigation of coagulation parameters was undertaken in parallel to routine laboratory tests, while coagulation tests were repeated after heart catheterization, partial or total surgical repair of underlying defect in a small subgroup of 6 neonates. The following coagulation parameters were measured: PT, APTT, Fibrinogen, FII, FVII, FVIII, FIX, FX, VWF, Rcof, AT, PC, PS, D-dimer and ADAMTS-13. Results: Infection group: Clotting times were prolonged in the acute phase of infection in comparison to controls and recovery. FII and FVII levels were lower in the acute phase of infection compared to controls. FVII concentrations were lower in the acute phase of infection compared to recovery. On the other hand, fibrinogen, FVIII and VWF were significantly higher in the acute phase in comparison to controls and recovery, while they remained persistently higher in the infection group compared to controls. In regards to anticlotting mechanism, a clear suppression was observed in septic neonates. An intriguing result was the identification of lower D-dimer levels in the infection group compared to control group. ADAMTS-13 levels were significantly lower in acute phase of infection compared to controls and recovery, while a trend towards superimposed normalization was present post infection. ROC analysis of ADAMTS-13 as a predictor of infection was AUC= 0.736, CI95% 0.564–0.908, p= 0.019. The chosen cutoff value was 545.5 ng/mL, with sensitivity 72% and specificity 75%. A significant negative correlation was demonstrated between VWF and ADAMTS-13 levels in acute phase of infection. What is more, nSOFA score was positively correlated with VWF levels and negatively correlated with ADAMTS13 levels in the acute phase of infection. CHD group: PT was significantly prolonged and accordingly FVII levels were lower in neonates with CHD compared to controls. On the other hand, FVIII, VWF and Rcof levels were substantially higher in the CHD group compared to controls, while no significant difference was demonstrated in regards to natural anticoagulants. ADAMTS-13 concentrations were lower in neonates with CHD in comparison to controls, but difference was not statistically significant. D-dimer levels were lower in neonates with CHD compared to controls, a finding doubting the traditional assumption that CHD is accompanied by lowgrade DIC. Comparison of coagulation profile between cyanotic and non-cyanotic CHD did not reveal any significant discrepancies. However, coagulation abnormalities were more pronounced in prostaglandin-dependent CHD rather than nonprostaglandin CHD. In the small group of patients that tests were repeated after cardiac catheterization or surgical repair, elevated D-dimer levels were observed post intervention. Finally, coagulation parameters were not correlated with disease severity as assessed by Bethesda classification system. However, PT was significantly prolonged and accordingly FVII levels were significantly lower in cases with poor prognosis, indicating a clear association between coagulation profile and outcome. Conclusion: The hemostatic mechanism during neonatal age represents an evolving, although balanced process. A derangement towards hemorrhage or thrombosis can rapidly develop under particular conditions. Sepsis is a well-described and common trigger of coagulation cascade, resulting in significant derangement of clotting and anticlotting mechanism. Identification of lower D-dimer levels in septic neonates compared to controls raises concerns about classical DIC diagnostic criteria and should be further investigated in future studies. The role of ADAMTS-13 in adult sepsis has been thoroughly studied. To the best of our knowledge, our study represents the first study about ADAMTS-13 implication in neonatal sepsis. Our findings indicate possible usefulness of ADAMTS-13 substitution in septic neonates, which has been proposed as an adjuvant tool in sepsis treatment, currently under investigation. CHD is associated with major morbidity and mortality and coagulation abnormalities are a poor prognostic factor. The role of ADAMTS-13 has been investigated in older children with CHD with conflicting results between studies. To the best of our knowledge, our study is the first study giving insight into the role of ADAMTS-13 in neonates with CHD. Lower levels of ADAMTS-13 in neonates with CHD indicates an additional prothrombotic risk factor in neonates with CHD.

Εισαγωγή: Ο μηχανισμός αιμόστασης παρουσιάζει σημαντικές διαφορές στη νεογνική ηλικία συγκριτικά με τα μεγαλύτερα παιδιά και τους ενήλικες και οι διαφορές αυτές έχουν οδηγήσει στην καθιέρωση του όρου «αναπτυξιακή αιμόσταση» (developmental hemostasis), έννοια που αντικατοπτρίζει τη δυναμική εξέλιξη και ωρίμανση του αιμοστατικού μηχανισμού καθόλη τη διάρκεια της παιδικής ηλικίας. Ορισμένοι προπηκτικοί και αντιπηκτικοί παράγοντες ανευρίσκονται σε χαμηλότερα επίπεδα στο πλάσμα νεογνών, ενώ άλλοι παράγοντες πήξης, κυρίως οι FVIII και VWF είναι αυξημένοι. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει προκύψει τα τελευταία χρόνια σχετικά με το ρόλο της πρωτεΐνης ADAMTS-13, της πρωτεΐνης κάθαρσης του VWF, στη νεογνική αιμόσταση, καθώς και σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις. Παρά τις όποιες διαφοροποιήσεις, ο μηχανισμός πήξης παραμένει ισορροπημένος και το υγιές, τελειόμηνο νεογνό δε διατρέχει αυξημένο κίνδυνο αιμορραγίας ή θρόμβωσης. Η ισορροπία αυτή διαταράσσεται εύκολα στα νεογνά που νοσηλεύονται στις ΜΕΝΝ λόγω διαφόρων παραγόντων, όπως είναι η προωρότητα, η λοίμωξη, η περιγεννητική ασφυξία, ο καθετηριασμός αγγείων κ.α. Η νεογνική λοίμωξη επιπλέκει συχνά την κλινική πορεία των νεογνών που νοσηλεύονται στη ΜΕΝΝ και αυξάνει σημαντικά τη νοσηρότητα και θνητότητα. Παράλληλα, η ενεργοποίηση της φλεγμονώδους διεργασίας συνοδεύεται από ταυτόχρονη ενεργοποίηση του μηχανισμού πήξης και η αλληλεπίδραση αυτή περιγράφεται με τον όρο «ανοσοθρόμβωση» (immunothrombosis or thromboinflammation), έννοια που αποκτά όλο και μεγαλύτερο έδαφος. Η ανοσοθρόμβωση αποτελεί κατά βάση έναν αμυντικό μηχανισμό του οργανισμού, αλλά η υπέρμετρη ενεργοποίησή της οδηγεί στην εμφάνιση σοβαρών και απειλητικών για τη ζωή επιπλοκών. Παράλληλα, οι συγγενείς καρδιοπάθειες αντιπροσωπεύουν μία νοσολογική οντότητα που επίσης συνοδεύεται από σημαντική διαταραχή του μηχανισμού πήξης. Η αιτιοπαθογένεια των αιμοστατικών διαταραχών σε αυτή την ομάδα ασθενών είναι πολυπαραγοντική και περιλαμβάνει την ηπατική δυσλειτουργία, τη δευτεροπαθή ερυθροκυττάρωση, την υποξία κ.α. Επιπλέον, οι διαταραχές πήξης επιβαρύνουν σημαντικά την πρόγνωση αυτών των ασθενών, ενώ θρομβοεμβολικά επεισόδια μπορεί να παρατηρηθούν ακόμη και αρκετά χρόνια μετά τη χειρουργική διόρθωση. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση των διαταραχών των παραγόντων πήξης, των φυσικών ανασταλτών της πήξης και της πρωτεΐνης ADAMTS-13 σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά με λοίμωξη ή συγγενή καρδιοπάθεια. Υλικό και Μέθοδος: Ο πληθυσμός της μελέτης περιλαμβάνει 16 πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά με πρώιμη και όψιμη νεογνική λοίμωξη και 20 νεογνά με κυανωτική ή μη κυανωτική συγγενή καρδιοπάθεια. Επίσης, ο πληθυσμός της μελέτης περιλαμβάνει 18 υγιή νεογνά-μάρτυρες. Στην ομάδα των λοιμώξεων οι παράμετροι πήξης μετρήθηκαν αρχικά στην οξεία φάση της λοίμωξης και εν συνεχεία μετά την αποδρομή αυτής. Η διάγνωση της λοίμωξης στηρίχθηκε στην κλινική σημειολογία και συμπτωματολογία ενδεικτική λοίμωξης, στην ανεύρεση θετικών δεικτών λοίμωξης ή/και θετικής καλλιέργειας αίματος και στη διάρκεια χορήγησης αντιβιοτικής αγωγής για τουλάχιστον 10 ημέρες. Η διάγνωση δε βασίστηκε αποκλειστικά στη θετική καλλιέργεια αίματος ή άλλου φυσιολογικά στείρου βιολογικού υγρού, καθώς τις περισσότερες φορές είχε προηγηθεί χορήγηση αντιβίωσης στο νεογνό ή/και τη μητέρα. Η βαρύτητα της λοίμωξης εκτιμήθηκε με βάση την κλίμακα nSOFA. Στην ομάδα των συγγενών καρδιοπαθειών ο έλεγχος των παραμέτρων πήξης έγινε στα πλαίσια του γενικότερου εργαστηριακού ελέγχου, ενώ σε μία μικρή ομάδα 6 ασθενών έγινε επανάληψη των μετρήσεων μετά τη διενέργεια καθετηριασμού καρδιάς, μερικής ή ολικής χειρουργικής διόρθωσης της υποκείμενης συγγενούς καρδιοπάθειας. Οι παράμετροι πήξης που μετρήθηκαν και στις τρεις ομάδες της μελέτης ήταν οι εξής: PT, APTT, Ινωδογόνο, FII, FVII, FVIII, FIX, FX, VWF, Rcof, AT, PC, PS, D-dimer και ADAMTS-13. Αποτελέσματα: Ομάδα λοιμώξεων: Οι χρόνοι πήξης ήταν παρατεταμένοι στην οξεία φάση της λοίμωξης σε σύγκριση με τα υγιή νεογνά-μάρτυρες και την αποδρομή της λοίμωξης. Τα επίπεδα των FII και FVII ήταν χαμηλότερα στην οξεία φάση λοίμωξης συγκριτικά με την ομάδα των μαρτύρων. Οι τιμές του FVII ήταν σημαντικά χαμηλότερες στην οξεία φάση λοίμωξης συγκριτικά με την αποδρομή. Αντίθετα, οι συγκεντρώσεις του ινωδογόνου, του FVIII και του VWF ήταν υψηλότερες στην οξεία φάση της λοίμωξης σε σύγκριση με τα υγιή νεογνά-μάρτυρες και την αποδρομή της λοίμωξης και παρέμειναν αυξημένες και μετά την αποδρομή σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Το σύστημα των φυσικών ανασταλτών της πήξης ήταν σημαντικά κατεσταλμένο στα πάσχοντα νεογνά, καθώς τα επίπεδα της AT και της PC ήταν χαμηλότερα στην οξεία φάση της λοίμωξης συγκριτικά με τους μάρτυρες. Επίσης, οι συγκεντρώσεις της AT και της PS ήταν μειωμένες στην οξεία φάση σε σύγκριση με την αποδρομή της λοίμωξης. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η μέτρηση χαμηλότερων επιπέδων D-dimer στα πάσχοντα νεογνά συγκριτικά με τα υγιή νεογνά. Όσον αφορά τα επίπεδα της ADAMTS-13, αυτά ήταν χαμηλότερα στην οξεία φάση λοίμωξης συγκριτικά με τα υγιή νεογνά-μάρτυρες και την αποδρομή της λοίμωξης, ενώ μία τάση υπερβολικής αποκατάστασης παρατηρήθηκε στη φάση της αποδρομής. Τα αποτελέσματα της ROC ανάλυση σχετικά με την ADAMTS-13 ως προγνωστικός δείκτης λοίμωξης ήταν: AUC = 0.736, CI95% 0.564–0.908, p= 0.019. Το όριο που επιλέχθηκε ήταν 545.5 ng/ml, με ευαισθησία 72% και ειδικότητα 75%. Στην οξεία φάση της λοίμωξης διαπιστώθηκε σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του VWF και της ADAMTS-13. Επίσης, οι τιμές του VWF παρουσίασαν θετική συσχέτιση με την κλίμακα nSOFA, ενώ αντίθετα τα επίπεδα της ADAMTS-13 είχαν αρνητική συσχέτιση με τη συγκεκριμένη κλίμακα. Ομάδα συγγενών καρδιοπαθειών: Ο PT ήταν σημαντικά παρατεταμένος και αναλόγως τα επίπεδα του FVII ήταν χαμηλότερα στα νεογνά με συγγενή καρδιοπάθεια συγκριτικά με τα υγιή νεογνά-μάρτυρες. Αντίθετα, οι συγκεντρώσεις των FVIII, VWF και Rcof ήταν σημαντικά υψηλότερες στην ομάδα των πασχόντων νεογνών σε σύγκριση με την ομάδα των μαρτύρων, ενώ το σύστημα των φυσικών ανασταλτών της πήξης δεν παρουσίασε σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων. Τα επίπεδα της ADAMTS-13 ήταν χαμηλότερα στα πάσχοντα νεογνά συγκριτικά με τα υγιή, αν και η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Οι τιμές των D-dimer ήταν μειωμένες στα νεογνά με συγγενή καρδιοπάθεια σε σύγκριση με τα υγιή νεογνά, εύρημα που θέτει υπό αμφισβήτηση την παραδοσιακή αντίληψη ότι οι συγγενείς καρδιοπάθειες συνοδεύονται από ήπιου βαθμού DIC. Η σύγκριση μεταξύ κυανωτικών και μη-κυανωτικών συγγενών καρδιοπαθειών δεν ανέδειξε σημαντικές διαφορές, ωστόσο το αιμοστατικό προφίλ ήταν σαφώς περισσότερο επηρεασμένο στις πορο-εξαρτώμενες καρδιοπάθειες συγκριτικά με τις μη πορο-εξαρτώμενες. Στις περιπτώσεις που έγινε επανάληψη των μετρήσεων μετά τη διενέργεια καθετηριασμού καρδιάς ή χειρουργικής διόρθωσης, διαπιστώθηκαν αυξημένες τιμές D-dimer μετά την επέμβαση. Τέλος, οι παράμετροι πήξης δεν παρουσίασαν σημαντική συσχέτιση με τη βαρύτητα της υποκείμενης καρδιοπάθειας, όπως αυτή εκτιμήθηκε με το σύστημα Bethesda. Ωστόσο, ο PT ήταν σημαντικά παρατεταμένος και αναλόγως τα επίπεδα του FVII σημαντικά χαμηλότερα στις περιπτώσεις με δυσμενή έκβαση, υποδεικνύοντας καθαρή συσχέτιση του αιμοστατικού προφίλ και της πρόγνωσης. Συμπεράσματα: Ο μηχανισμός πήξης στη νεογνική ηλικία αποτελεί μία δυναμικά εξελισσόμενη διαδικασία που διατηρείται σε ισορροπία, αλλά εύκολα μπορεί να εκτραπεί προς την κατεύθυνση είτε της αιμορραγίας είτε της θρόμβωσης. Η λοίμωξη αποτελεί καλά αναγνωρισμένη και συχνή αιτία ενεργοποίησης του καταρράκτη της πήξης, με αποτέλεσμα ο πηκτικός και αντιπηκτικός μηχανισμός να διαταράσσεται σημαντικά στις περιπτώσεις νεογνικής λοίμωξης. Η ανεύρεση χαμηλότερων τιμών D-dimer στα νεογνά με λοίμωξη συγκριτικά με τους μάρτυρες θέτει υπό αμφισβήτηση τα κλασσικά κριτήρια διάγνωσης της DIC και χρήζει περαιτέρω διερεύνησης σε μελλοντικές μελέτες. Η ADAMTS-13 έχει διερευνηθεί εκτενώς σε ενήλικες σηπτικούς ασθενείς, αλλά κατά το μέγιστο δυνατό των γνώσεων μας η δική μας μελέτη αποτελεί την πρώτη μελέτη διερεύνησης του ρόλου της ADAMTS-13 στη νεογνική σηψαιμία. Τα ευρήματα της μελέτης μας υποδεικνύουν την πιθανή χρησιμότητα της θεραπείας υποκατάστασης της ADAMTS-13 στα νεογνά με λοίμωξη, η οποία έχει αρχίσει να μελετάται ως ένα νέο θεραπευτικό όπλο στη σήψη. Οι συγγενείς καρδιοπάθειες συνοδεύονται από σημαντική νοσηρότητα και θνητότητα και η πρόγνωση επιβαρύνεται σημαντικά από τις συνοδές διαταραχές του αιμοστατικού μηχανισμού. Η πρωτεΐνη ADAMTS-13 έχει μελετηθεί σε μεγαλύτερα βρέφη και παιδιά με συγγενείς καρδιοπάθειες με αντικρουόμενα αποτελέσματα μεταξύ των διαφόρων μελετών. Κατά το μέγιστο δυνατό των γνώσεων μας η δική μας μελέτη διερευνά για πρώτη φορά το ρόλο της πρωτεΐνης ADAMTS-13 στα νεογνά με συγγενή καρδιοπάθεια. Η μέτρηση χαμηλότερων επιπέδων ADAMTS-13 στα πάσχοντα νεογνά υποδεικνύει έναν πρόσθετο παράγοντα στον ήδη αυξημένο κίνδυνο θρομβωτικών επιπλοκών σε αυτή την ομάδα ασθενών.