Γενετική και μεταγραφωμική ανάλυση παραγόντων που διαμορφώνουν ποιοτικά χαρακτηριστικά στη φακή

Abstract

Lentil (Lens culinaris Medik.) is one of the earliest domesticated plants and one of the most widespread crops due to its economic importance and high nutritional value. Lentil consumption has been linked to favorable health outcomes and gained significant popularity in recent years. Despite its beneficial properties, the high content of phenolic compounds, and specifically the accumulation of tannins in the seed coat, poses a challenge to its overall quality. Tannins, despite their antioxidant and antimicrobial properties, can limit digestion and absorption of nutrients, making them antinutritional factors. Lentil, like the majority of legumes, is characterized by the "Hard-To-Cook" phenomenon, which is attributed to the seed coat hardness. Long cooking time, is an important quality characteristic for consumers and is an important target for breeders. Moreover, considering the reports of heterogeneity in seed coat hardness in Greece, further research is needed on the mechanisms that affect this phenomenon. Another factor that affects lentil cultivation is phosphorus fertilization, as adequate amounts are required for its desired yield. According to the above, the purpose of the present work was to investigate the mechanisms through the gene expression that are affected by phosphorus fertilization. To achieve this goal, an analysis of the lentil transcriptome was conducted using samples of pods collected at three different maturation stages. (S1: when the seed in the pod was still immature, S2: when the seed in the pod was fully grown and mature, S3: when the pod was at the stage of discoloration), in three phosphorus treatments P0 (6.7 mg/kg), P1 (15 mg/kg), P2 (15 mg/kg +6 mg/kg that were added at flowering days). Additionally, followed by studying certain agricultural characteristics to enhance the conclusions. The experiment was conducted in three genotypes, the commercial variety "SAMOS" and two populations "P118" and "KD101".The additional amounts of phosphorus of the P1 and P2 treatments led to significantly negative expression of cytochrome P450 genes that are involved in defense mechanisms and response to biotic and abiotic stresses, while fluctuations were also observed between the stages of maturation of the pod and in the three genotypes. Additionally, at these levels of phosphorus, there was a strong downregulation of the legume lectin protein family genes, which play an important role in the response to stress and in the binding of metal ions during seed development. The effect of both phosphorus fertilization of the P1 and P2 treatments and the genotype was also confirmed by the overexpression of the flavonol-3-O-glycoside-7-O-glucosyltransferase 1 gene in the "P118" and "KD101" genotypes, indicating the presence of glycosylated forms of flavonoids, an undesirable trait, hinders their absorption by the organism. The additional phosphorus is anticipated to compromise seed quality by impeding the movement and storage of metal ions, as indicated by the impact on the expression of genes associated with this function. The majority of changes in expression were detected from the second stage of maturation of the pod to the third. However, the changes that occur from the early stages are more interesting as the seed has not yet been exposed to factors that could cause stress and it also has the necessary components in larger quantities for its survival. An exceptional case was the downregulation of O-methyltransferase genes from the very first stage of maturation of the pod that was observed in all three genotypes and suggests interference of factors in seed development and possibly reduced response to stresses. In the "SAMOS" variety, conversely, there was a notable upregulation in S3 in the cupin family genes associated with seed defense mechanisms. This implies that this particular variety exhibits a more robust response to phosphorus fertilization, manifesting in the development of adaptive and responsive mechanisms. In addition, the stage of maturation of the pod seemed to be a determining factor in the changes in expression of genes in the phenylpropanoid pathway. The expression of these genes between genotypes showed small changes, while between phosphorus treatments no comparable pattern emerged in the changes in expression. Among the genes that seemed to be affected by the stage of pod’s maturation are the genes ANR and LAR that are directly related to the accumulation of tannins in the seed. A notable finding is that the genes F3H and FLS deviate from any discernible pattern in their expression when compared to the other genes in the pathway. The comprehensive analysis of the data obtained from transcriptome sequencing in this thesis yielded crucial insights into the mechanisms influenced by phosphorus fertilization and the maturation stage of the pod. Furthermore, investigating gene expression across different genotypes enhanced the research, highlighting the pivotal role of genotype in responding to mechanisms triggered by the supplemental application of phosphorus. The observation of variations in the differential expression and the absence of specific patterns, both related to phosphorus fertilization and the maturation stage of the pod, may be attributed to the influence of transcriptional factors and proteins not yet identified in lentils. Identifying these factors is crucial to facilitate the in-depth study of traits for further investigation by breeders.

Η φακή ( Lens culinaris Medik.) είναι από τα πρώτα φυτά που εξημέρωσε ο άνθρωπος και από τις πιο διαδεδομένες καλλιέργειες λόγω της οικονομικής της σημασίας και της υψηλής διατροφικής της αξίας. Η διατροφική αξία της φακής συνδέεται με θετικά αποτελέσματα στην υγεία και τα τελευταία χρόνια έχει αυξηθεί πολύ η κατανάλωσή της. Παρά τις ευεργετικές της ιδιότητες, η υψηλή περιεκτικότητά της σε φαινολικές ενώσεις, και συγκεκριμένα η συσσώρευση ταννινών στο περίβλημα του σπόρου, υποβαθμίζουν την ποιότητά της. Οι ταννίνες, παρά τις αντιοξειδωτικές και αντιμικροβιακές τους ιδιότητες, μπορούν να περιορίσουν την πέψη και την απορρόφηση θρεπτικών ουσιών, καθιστώντας τις έτσι ως αντιθρεπτικούς παράγοντες. Η φακή, όπως και η πλειοψηφία των ψυχανθών χαρακτηρίζεται από το φαινόμενο "Hard-To-Cook" (Δυσκολία στο Μαγείρεμα), που οφείλεται σε παράγοντες όπως η σκληρότητα του περισπερμίου. Ο χαμηλός χρόνος βρασμού, αποτελεί σημαντικό ποιοτικό χαρακτηριστικό για τους καταναλωτές και σημαντικό στόχο για τη βελτίωση της φακής. Λαμβάνοντας υπόψη τις αναφορές για ανομοιομορφία στη σκληρότητα του περιβλήματος στον ελλαδικό χώρο, απαιτείται περαιτέρω έρευνα των μηχανισμών που επηρεάζουν το φαινόμενο αυτό. Ένας ακόμη παράγοντας που επηρεάζει την καλλιέργεια φακής είναι η φωσφορική λίπανση, καθώς απαιτούνται επαρκείς ποσότητες για την επιθυμητή απόδοσή της. Σύμφωνα με τα παραπάνω, ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση των μηχανισμών σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης που επιδρά η λίπανση φωσφόρου. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκε το μεταγράφωμα της φακής σε δείγματα λοβών που λήφθηκαν σε τρία στάδια ωρίμανσης (S1: όταν ο σπόρος στο λοβό ήταν ακόμη ανώριμος, S2: όταν ο σπόρος στο λοβό ήταν πλήρους μεγέθους και ώριμος, S3: όταν ο λοβός ήταν στο στάδιο του μεταχρωματισμού), σε τρεις μεταχειρίσεις φωσφόρου Ρ0 (6,7 mg/kg), P1 (15 mg/kg), P2 (15 mg/kg +6 mg/kg που προστέθηκαν στην άνθιση). Επιπλέον, ακολούθησε και μελέτη ορισμένων αγροκομικών χαρακτηριστικών με σκοπό την ενίσχυση των συμπερασμάτων. Ο πειραματισμός πραγματοποιήθηκε σε τρεις γενότυπους, την εμπορική ποικιλία «ΣΑΜΟΣ» και σε δύο πληθυσμούς «Ρ118» και «KD101».Οι επιπλέον ποσότητες φωσφόρου των μεταχειρίσεων Ρ1 και Ρ2 οδήγησαν σε σημαντικά αρνητική έκφραση των γονιδίων του cytochrome Ρ450 που σχετίζονται με μηχανισμούς άμυνας και απόκρισης σε βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις, ενώ διακυμάνσεις παρατηρήθηκαν και μεταξύ των σταδίων ωρίμανσης του λοβού και στους τρεις γενότυπους. Επιπλέον, σε αυτά τα επίπεδα φωσφόρου παρατηρήθηκε έντονα αρνητική έκφραση γονιδίων της οικογένειας legume lectin protein, που παίζουν εξίσου σημαντικό ρόλο στην απόκριση στην καταπόνηση και στη δέσμευση μεταλλικών ιόντων κατά την ανάπτυξη του σπόρου. Η επίδραση τόσο της φωσφορικής λίπανσης των μεταχειρίσεων Ρ1 και Ρ2 όσο και του γενότυπου επιβεβαιώθηκε και από την υπερ- έκφραση του γονιδίου flavonol-3-O-glycoside-7-O-glucosyltransferase 1 στους γενότυπους «Ρ118» και «KD101», που υποδεικνύει την ύπαρξη γλυκοζυλιωμένων μορφών φλαβονοειδών που πρόκειται για ανεπιθύμητο χαρακτηριστικό καθώς οδηγούν σε πιο δύσκολη απορρόφησή τους από τον οργανισμό. Ο επιπλέον φώσφορος πιθανώς οδηγεί σε υποβάθμιση της ποιότητας του σπόρου λόγω μειωμένης κινητικότητας και αποθήκευσης μεταλλικών ιόντων, όπως προέκυψε από την επίδραση στην έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με αυτή τη λειτουργία.Η πλειοψηφία των αλλαγών στην έκφραση εντοπίστηκε από το δεύτερο στάδιο ωρίμανσης του λοβού στο τρίτο. Ωστόσο είναι πιο ενδιαφέρουσες οι αλλαγές που συμβαίνουν από στα νεαρότερα στάδια καθώς ακόμη ο σπόρος δεν έχε εκτεθεί σε παράγοντες που θα μπορούσαν να προκαλέσουν καταπόνηση και επιπλέον διαθέτει ακόμη σε μεγαλύτερες ποσότητες τα απαραίτητα συστατικά για την επιβίωσή του. Χαρακτηριστική περίπτωση ήταν η αρνητική έκφραση των γονιδίων O-methyltransferase από τα πρώτα μόλις στάδια ωρίμανσης του λοβού που παρατηρήθηκε και στους τρεις γενότυπους και υποδηλώνει παρέμβαση παραγόντων στην ανάπτυξη του σπόρου και πιθανώς μείωση της ανταπόκρισης σε καταπονήσεις. Στην ποικιλία «ΣAMOΣ» όμως βρέθηκε υψηλή έκφραση στο S3 σε γονίδια της οικογένειας cupin που σχετίζονται με μηχανισμούς άμυνας στο σπόρο, υποδηλώνοντας ότι η ποικιλία αυτή ανταποκρίνεται καλύτερα στην φωσφορική λίπανση αναπτύσσοντας μηχανισμούς απόκρισης και προσαρμογής. Επιπλέον, το στάδιο ωρίμανσης του λοβού φάνηκε να είναι καθοριστικός παράγοντας στις μεταβολές έκφρασης των γονιδίων στο φαινυλ-προπανοϊκό μονοπάτι. Η έκφραση των γονιδίων αυτών μεταξύ των γενοτύπων παρουσίασε μικρές αλλαγές, ενώ μεταξύ μεταχειρίσεων φωσφόρου δεν προέκυψε κάποιο συγκριμένο μοτίβο στις μεταβολές στην έκφραση. Μεταξύ των γονιδίων που φάνηκε να επηρεάζει το στάδιο ωρίμανσης είναι τα γονίδια ΑΝR και LAR που σχετίζονται άμεσα με την συσσώρευση ταννινών στο σπόρο. Αξιοσημείωτο εύρημα είναι πως τα γονίδια F3H και FLS δεν ακολουθούν κανένα μοτίβο στην έκφρασή τους συγκριτικά με τα υπόλοιπα γονίδια της οδού.Το σύνολο της ανάλυσης των δεδομένων που προέκυψε από την αλληλούχιση του μεταγραφώματος στην παρούσα διατριβή, έδωσε σημαντική πληροφορία εντοπισμού μηχανισμών που επηρεάζονται από τη φωσφορική λίπανση καθώς και το στάδιο ωρίμανσης του λοβού. Επιπροσθέτως, η μελέτη της γονιδιακής έκφρασης σε διαφορετικούς γενότυπους ενίσχυσε την έρευνα καθώς, όπως φάνηκε ο παράγοντας γενότυπος ήταν καθοριστικός για την απόκριση σε μηχανισμούς που πυροδότησε η επιπλέον προσθήκη φωσφόρου. Η παρατήρηση διακυμάνσεων στη διαφορική έκφραση και η απουσία συγκεκριμένων μοτίβων τόσο σχετικών με τη φωσφορική λίπανση όσο και με το στάδιο ωρίμανσης του λοβού, πιθανώς να οφείλεται στην επίδραση των μεταγραφικών παραγόντων καθώς και πρωτεϊνών που δεν έχουν ακόμη αναγνωριστεί στη φακή και είναι σημαντικό να ταυτοποιηθούν ώστε να διευκολυνθεί η μελέτη χαρακτήρων που υπόκεινται σε βελτίωση.