Identification & characterization of a rice spikelet-specific germin-like protein: is superoxide dismutase activity its only role?

Abstract

Reactive oxygen species (ROS) such as superoxide, peroxide, hydroxyl ion, and singlet oxygen radicals are by-products of specific metabolic reactions in plants. ROS damage cellular biomolecules and are thus actively scavenged. However, ROS also act as signal transducers during development and stress responses. Redox enzymes such as superoxide dismutase (SOD) contribute to achieving a balance between ROS being scavenged and being available as signal transducers. Spatio-temporally differential expression of SODs in various tissues plays a critical role in scavenging the superoxide radical. Using a nitroblue-tetrazolium-riboflavin-based in-gel SOD assay, up-regulation of two low mobility (~96 kDa and ~92 kDa) putative SODs was observed in rice spikelets. The two proteins were purified by gel electrophoresis and both were identified through mass spectrometry as homotetrameric versions of a single germin-like protein (GLP), encoded by the gene LOC_Os08g08960 (Rice Genome Annotation Project). Staining with a glycoprotein gel stain and enzymatic deglycosylation showed that the protein is post-translationally modified by N-glycosylation; differential modification probably accounts for the difference between the two forms. Biochemical characterization of this developmentally regulated spikelet-specific GLP (ssGLP) indicated that its SOD activity is Mn-SOD type and is highly stable in denaturing agents and at elevated temperatures. Tetrameric ssGLP lacks oxalate oxidase activity. The biological functions of GLPs have not been fully defined; among the different functions attributed to them their role in biotic stress tolerance is relatively well studied. Rice germins, especially some of those with genes on chromosome 8 in the same cluster as the LOC_Os08g08960 gene, although not this specific gene, have previously been found to contribute to the basal mechanism of resistance to pathogens causing rice blast and sheath blight disease. ssGLP was estimated to contribute nearly 11% of the total SOD activity in rice spikelets, indicating a crucial developmental role. Expression analysis with the in-gel SOD assay at the spatiotemporal level, as well as treatment with various hormones, chemicals, and abiotic variables such as wounding and light, indicated that the expression of ssGLP is affected by developmental rather than stress stimuli. Further, expression analysis at the spatio-temporal level through RT-PCR confirmed the developmental patterns observed previously at the protein level. In situ mRNA hybridization studies provided evidence for ssGLP gene expression in pollen and endosperm and in localized regions of leaves and for the production of antisense RNA. Consistent with the up-regulation in spikelets, in silico comparison of the rice GLP promoters revealed more seed and pollen-specific motifs in LOC_Os08g08960 than in other GLP genes. Additionally, the presence of a GAF protein domain typical of cyclic nucleotide phosphodiesterases is unique to ssGLP. Preliminary enzyme assays and in silico results suggested that ssGLP may act as a nucleotide-sugar pyrophosphatase/phosphodiesterase (NSPPase) similar to a previously described barley GLP. As a first step to a fuller definition of the enzyme activity of ssGLP and in particular to test the hypothesis that a different oligomeric configuration acts as NSPPase, a gene for recombinant ssGLP was constructed, cloned, and expressed in Pichia pastoris.

Τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) όπως το υπεροξείδιο, το υπεροξείδιο, το ιόν υδροξυλίου και οι ρίζες οξυγόνου είναι υποπροϊόντα συγκεκριμένων μεταβολικών αντιδράσεων στα φυτά. Οι ROS βλάπτουν τα κυτταρικά βιομόρια και έτσι σαρώνονται ενεργά. Ωστόσο, οι ROS λειτουργούν επίσης ως μορφοτροπείς σήματος κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και των αντιδράσεων στο στρες. Τα οξειδοαναγωγικά ένζυμα όπως η δισμουτάση υπεροξειδίου (SOD) συμβάλλουν στην επίτευξη ισορροπίας μεταξύ των ROS που σαρώνονται και είναι διαθέσιμα ως μετατροπείς σήματος. Η χωροχρονικά διαφορική έκφραση των SOD σε διάφορους ιστούς παίζει κρίσιμο ρόλο στην απομάκρυνση της ρίζας υπεροξειδίου. Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία SOD με βάση το νιτρομπλε-τετραζόλιο-ριβοφλαβίνη, παρατηρήθηκε ρύθμιση δύο υποθετικών SOD χαμηλής κινητικότητας (~96 kDa και ~92 kDa) σε αιχμές ρυζιού. Οι δύο πρωτεΐνες καθαρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής και οι δύο αναγνωρίστηκαν μέσω φασματομετρίας μάζας ως ομοτετραμερείς εκδόσεις μιας μοναδικής πρωτεΐνης που μοιάζει με βλαστίνη (GLP), κωδικοποιημένη από το γονίδιο LOC_Os08g08960 (Rice Genome Annotation Project). Η χρώση με χρώση πηκτής γλυκοπρωτεΐνης και ενζυματική απογλυκοζυλίωση έδειξε ότι η πρωτεΐνη τροποποιείται μετα-μεταφραστικά με Ν-γλυκοζυλίωση. Η διαφορική τροποποίηση πιθανώς εξηγεί τη διαφορά μεταξύ των δύο μορφών. Ο βιοχημικός χαρακτηρισμός αυτού του αναπτυξιακά ρυθμιζόμενου ειδικού GLP spikelet (ssGLP) έδειξε ότι η δραστικότητά του SOD είναι τύπου Mn-SOD και είναι εξαιρετικά σταθερή σε παράγοντες μετουσίωσης και σε υψηλές θερμοκρασίες. Το τετραμερές ssGLP στερείται δραστικότητας οξειδάσης οξαλικού. Οι βιολογικές λειτουργίες των ΟΕΠ δεν έχουν καθοριστεί πλήρως. Μεταξύ των διαφόρων λειτουργιών που τους αποδίδονται, ο ρόλος τους στην ανοχή στο βιοτικό στρες είναι σχετικά καλά μελετημένος. Τα μικρόβια ρυζιού, ειδικά μερικά από εκείνα με γονίδια στο χρωμόσωμα 8 στο ίδιο σύμπλεγμα με το γονίδιο LOC_Os08g08960, αν και όχι αυτό το συγκεκριμένο γονίδιο, έχουν βρεθεί προηγουμένως ότι συμβάλλουν στον βασικό μηχανισμό αντοχής σε παθογόνα που προκαλούν έκρηξη ρυζιού και ασθένεια θήκης. Το ssGLP εκτιμάται ότι συνεισφέρει σχεδόν το 11% της συνολικής δραστηριότητας SOD στις αιχμές ρυζιού, υποδεικνύοντας έναν κρίσιμο αναπτυξιακό ρόλο. Η ανάλυση έκφρασης με τη δοκιμασία in-gel SOD σε χωροχρονικό επίπεδο, καθώς και η θεραπεία με διάφορες ορμόνες, χημικές ουσίες και αβιοτικές μεταβλητές όπως ο τραυματισμός και το φως, έδειξαν ότι η έκφραση του ssGLP επηρεάζεται από αναπτυξιακά και όχι από ερεθίσματα στρες. Περαιτέρω, η ανάλυση έκφρασης σε χωροχρονικό επίπεδο μέσω RT-PCR επιβεβαίωσε τα αναπτυξιακά πρότυπα που παρατηρήθηκαν προηγουμένως σε επίπεδο πρωτεΐνης. In situ μελέτες υβριδισμού mRNA παρείχαν στοιχεία για την έκφραση γονιδίων ssGLP στη γύρη και το ενδοσπέρμιο και σε εντοπισμένες περιοχές των φύλλων και για την παραγωγή αντινοηματικού RNA. Σύμφωνα με την αύξηση της ρύθμισης των ακίδων, η σύγκριση in silico των υποστηρικτών της ΟΕΠ ρυζιού αποκάλυψε περισσότερα μοτίβα σπόρων και γύρης σε LOC_Os08g08960 από ό, τι σε άλλα γονίδια ΟΕΠ. Επιπλέον, η παρουσία ενός τομέα πρωτεΐνης GAF χαρακτηριστικού των κυκλικών νουκλεοτιδικών φωσφοδιεστερασών είναι μοναδική για το ssGLP. Προκαταρκτικές δοκιμασίες ενζύμων και αποτελέσματα in silico έδειξαν ότι το ssGLP μπορεί να δράσει ως πυροφωσφατάση/φωσφοδιεστεράση νουκλεοτιδίου-σακχάρου (NSPPase) παρόμοιο με ένα GLP κριθαριού που περιγράφηκε προηγουμένως. Ως πρώτο βήμα για έναν πληρέστερο ορισμό της ενζυμικής δραστικότητας του ssGLP και ειδικότερα για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι μια διαφορετική ολιγομερής διαμόρφωση δρα ως NSPPase, ένα γονίδιο για την ανασυνδυασμένη ssGLP κατασκευάστηκε, κλωνοποιήθηκε και εκφράστηκε στο Pichia pastoris.