Μελέτη της ρύθμισης της έκφρασης γονιδίων μέσω του 3΄-tRF-CysGCA και του γονιδίου BCL2L12 μέσω νέων κυκλικών μορίων RNA, σε ανθρώπινα κύτταρα

Abstract

Non-coding RNA molecules, specifically tRNA derivatives (tDRs) and circular RNAs (circRNAs), have emerged as key players in regulating various biological processes. In the present PhD thesis, we delve into the multifaceted world of RNA regulation, focusing on 3′-tRF-CysGCA, a tRF derived from tRNACysGCA, and novel circRNAs of the BCL2L12 gene, shedding light on their roles in gene expression. tRNA fragments (tRFs) have garnered significant attention for their potential regulatory functions. Among these, 3′-tRFs have been of particular interest due to their association with gene expression. In this study, we explored the regulatory role of 3′-tRF-CysGCA in HEK-293 cells. This tRF, deriving from the cleavage in the T-loop of tRNACysGCA, has been previously shown to interact with Argonaute proteins, implicating its role in gene expression. However, its broader impact on human cells remained unexplored. To bridge this gap, stable overexpression of 3′-tRF-CysGCA in HEK-293 cells was conducted, followed by comprehensive transcriptomics and proteomics experiments. Our findings reveal significant alterations in the cellular expression profile, while extensive bioinformatics analysis pinpointed numerous pathways affected by the deregulation of 3′-tRF-CysGCA. Additionally, reporter assays confirmed the direct interaction of this fragment with TMPO transcript variant 1 and ERGIC1, leading to changes in their expression levels. Additionally, a cell density determination assay revealed the reduced cell proliferation ratio of HEK-293 clones compared to the parental cell line. This investigation underscores the substantial regulatory role of 3′-tRF-CysGCA in shaping gene expression and its potential significance in cellular processes. CircRNAs have recently emerged as a class of non-coding RNAs with crucial roles in gene regulation. In this study, we aimed to pioneer a high-throughput approach, employing long-read sequencing, to uncover novel circRNAs associated with the BCL2L12 gene, a member of the BCL2 family often implicated in colorectal cancer. To achieve this, we utilized multiple nested PCR assays with divergent primers targeting each BCL2L12 exon, followed by nanopore sequencing of the amplicons. Extensive data analysis, including the development of custom Perl-based algorithms, facilitated the identification of 46 novel BCL2L12 circRNAs. These circRNAs were shown to form through non-canonical back-splice sites, residing in highly similar regions of exons or introns of the primary transcripts. Furthermore, the study revealed two circRNAs containing poly(A) tracts, confirmed through Sanger sequencing and short-read sequencing. circ-BCL2L12-92, a specific circRNA identified in this study, shares miRNA-binding sites with the BCL2L12 mRNA. Silencing circ-BCL2L12-92 via siRNA transfection in HCT 116 cells resulted in the indirect downregulation of BCL2L12 mRNA, emphasizing the interconnectedness of circRNA biology with the regulation of gene expression. This observation highlights the potential role of circ-BCL2L12-92 as a modulator of BCL2L12 gene expression, uncovering a novel layer of complexity in the regulatory mechanisms governing gene expression. In conclusion, this study offers valuable insights into the regulatory roles of 3′-tRF-CysGCA and circ-BCL2L12-92 in gene expression and unveils a plethora of novel BCL2L12 circRNAs, shedding light on the complex landscape of non-coding RNA regulation. These findings open new avenues for further research, underlining the importance of these non-coding RNA molecules in gene expression regulation.

Tα μη κωδικά μόρια RNA (non-coding RNAs, ncRNAs), συγκεκριμένα τα θραύσματα tRNA (tRNA derivatives, tDRs) και κυκλικά RNA (circular RNAs, circRNAs), έχουν αναδειχθεί ως μόρια-ρυθμιστές σε διάφορες βιολογικές διεργασίες. Η παρούσα διδακτορική διατριβή, εμβαθύνει στον πολύπλευρο πεδίο της γονιδιακής ρύθμισης, εστιάζοντας στο 3′-tRF-CysGCA, ένα θραύσμα που προέρχεται από το tRNACysGCA και σε νέα circRNA του γονιδίου BCL2-like 12 (BCL2L12), αποκαλύπτοντας τους ρόλους τους στη γονιδιακή έκφραση. Τα tDRs έχουν κεντρίσει το ενδιαφέρον για τις πιθανές ρυθμιστικές τους λειτουργίες. Μεταξύ αυτών, τα 3′-tRFs έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω της συσχέτισής τους με τη γονιδιακή έκφραση. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, διερευνήθηκε ο ρυθμιστικός ρόλος του 3′-tRF-CysGCA στα κύτταρα HEK-293. Αυτό το tRF, που προέρχεται από τμήση στον βρόχο Τ του tRNACysGCA, έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες Argonaute, υποδηλώνοντας το ρόλο του στη γονιδιακή έκφραση. Ωστόσο, η ευρύτερη επίδρασή του στα ανθρώπινα κύτταρα παρέμεινε ανεξερεύνητη. Για να γεφυρωθεί αυτό το χάσμα, διεξήχθη σταθερή υπερέκφραση του 3′-tRF-CysGCA σε κύτταρα HEK-293, ακολουθούμενη από πειράματα μεταγραφομικής και πρωτεομικής. Τα ευρήματα των προαναφερθέντων πειραμάτων αποκαλύπτουν σημαντικές αλλαγές στο προφίλ κυτταρικής έκφρασης, ενώ η εκτενής βιοπληροφορική ανάλυση αποκάλυψε πολυάριθμες διεργασίες που επηρεάζονται από την υπερέκφραση του 3′-tRF-CysGCA. Επιπλέον, η δοκιμασία λουσιφεράσης επιβεβαίωσε την άμεση αλληλεπίδραση αυτού του tRF με το TMPO v.1 και το ERGIC1, οδηγώντας σε αλλαγές στα επίπεδα έκφρασής τους. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε δοκιμασία προσδιορισμού κυτταρικής πυκνότητας αποκάλυψε το μειωμένο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κλώνων ΗΕΚ-293 σε σύγκριση με τη μητρική κυτταρική σειρά. Τα αποτελέσματα αυτά αναδεικνύουν τον ουσιαστικό ρυθμιστικό ρόλο του 3′-tRF-CysGCA στη διαμόρφωση της γονιδιακής έκφρασης και τη δυνητική σημασία του στις κυτταρικές διεργασίες.Τα circRNAs αναδείχθηκαν πρόσφατα ως μια κατηγορία μη κωδικών RNA με ενεργό ρόλο στη γονιδιακή ρύθμιση. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, αναπτύχθηκε μια προσέγγιση υψηλής απόδοσης, χρησιμοποιώντας αλληλούχηση μεγάλων διαβασμάτων, για να ταυτοποιηθούν νέα circRNA που προέρχονται από το γονίδιο BCL2L12, ένα μέλος της οικογένειας BCL2 που εμπλέκεται στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Για να επιτευχθεί αυτό, χρησιμοποιήθηκαν πολλαπλές επάλληλες αντιδράσεις PCR με αποκλίνοντες εκκινητές που υβριδοποιούνταν σε κάθε εξώνιο του BCL2L12, ακολουθούμενο από αλληλούχηση με τεχνολογία νανοπόρων των προϊόντων PCR. Η εκτενής ανάλυση δεδομένων, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης προσαρμοσμένων αλγορίθμων σε γλώσσα Perl, επέτρεψε τον εντοπισμό 46 νέων BCL2L12 circRNA. Αυτά τα circRNAs φάνηκε να σχηματίζονται μέσω μη κανονικών θέσεων οπίσθιας συρραφής, που βρίσκονται σε εξωνιακές ή εσωνιακές περιοχές των πρόδρομων μεταγραφών που παρουσιάζουν υψηλή ομοιότητα στην αλληλουχία τους. Επιπλέον, η μελέτη αποκάλυψε δύο circRNAs που περιείχαν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες αδενινών, που επιβεβαιώθηκαν μέσω της αλληλούχησης κατά Sanger και αλληλούχησης επόμενης γενιάς. Το circ-BCL2L12-92, ένα νέο circRNA που ταυτοποιήθηκε, έχει κοινές θέσεις δέσμευσης microRNA με την 3′-αμετάφραστη περιοχή του BCL2L12 mRNA. Η μείωση των επιπέδων του circ-BCL2L12-92 μέσω διαμόλυνσης των κυττάρων HCT 116 με siRNA, είχε ως αποτέλεσμα την έμμεση μείωση του mRNA του BCL2L12, αναδεικνύοντας την εμπλοκή των circRNAs στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Αυτή η παρατήρηση αναδεικνύει τον πιθανό ρόλο του circ-BCL2L12-92 ως ρυθμιστή της έκφρασης του γονιδίου BCL2L12.Συμπερασματικά, η παρούσα διατριβή παρέχει νέες γνώσεις για το ρυθμιστικό ρόλο του 3′-tRF-CysGCA και του circ-BCL2L12-92 στη γονιδιακή έκφραση και αποκαλύπτει μια πληθώρα νέων circRNAs προερχόμενων από το BCL2L12. Αυτά τα ευρήματα ανοίγουν νέους δρόμους για περαιτέρω έρευνα, υπογραμμίζοντας τη σημασία αυτών των μη-κωδικών μορίων RNA στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης.