Κατασκευή βιο-λειτουργικών επιφανειών με χημεία click και τεχνικές φωτολιθογραφίας

Abstract

The aim of this PhD thesis is the modification of surfaces for biological applications such as the development of microarrays of biomolecules, using a new lithography technique called multi-cycle lithography in combination with «click» chemistry for the covalent attachment of biomolecules to a suitable substrate. In the present work dibenzylcyclooctyne and azide were used as reactive «click» groups. Also, azide photochemistry was studied as an alternative method for the successful immobilization of molecules. Processes were developed for attaching biomolecules to a substrate modified with an epoxy resin (EPR) film and to self-assembled monolayers SAMs bearing side groups with an epoxy ring or an amino group. Initially, covalent biotin derivatives or other molecules bearing groups suitable for subsequent «click» chemistry were attached to the modified surfaces. In each case, the successful immobilization of the molecules through «click» chemistry on the modified surfaces by reaction with a suitable fluorescent substance bearing a «click» chemistry group was studied. Azide photochemistry was used, exploiting their characteristic property that upon exposure to deep UV (254 nm) N2 is released producing nitrenes, which then react with the double bond of the polymer chains acting as cross-linkers. On the other hand, «click» chemistry was chosen as «click» reactions are characterized by very high yields, simplicity in implementation and are stereospecific. In addition, a lithographic scheme for biomolecule arrangement based on the use of photoresist that can be used in biocompatible conditions was studied. In this work, the possibility of using and extending the same approach for the development of microarrays from different proteins was investigated.

Σκοπός της διδακτορικής διατριβής είναι η τροποποίηση επιφανειών για βιολογικές εφαρμογές όπως η κατασκευή μικροσυστοιχίας βιομορίων, χρησιμοποιώντας μία νέα τεχνική λιθογραφίας ονομαζόμενη λιθογραφία πολλαπλών κύκλων (multi-cycle lithography) σε συνδυασμό με χημεία click για την ομοιοπολική πρόσδεση βιομορίων σε κατάλληλο υπόστρωμα. Στην παρούσα εργασία το διβενζυλοκυκλοοκτίνιο και το αζίδιο χρησιμοποιήθηκαν ως δραστικές «κλικ»ομάδες. Επίσης, μελετήθηκε η φωτοχημεία αζιδίων, ως εναλλακτική μέθοδος για την επιτυχή ακινητοποίηση μορίων. Αναπτύχθηκαν διεργασίες για την πρόσδεση βιομορίων σε υπόστρωμα τροποποιημένο με υμένιο εποξειδικής ρητίνης (EPR) και σε Αυτοοργανωμένα Μονομοριακά Στρώματα (self-assembled monolayers SAMs) που έφεραν πλευρικές ομάδες με εποξειδικό δακτύλιο ή αμινομάδα. Αρχικά, στις τροποποιημένες επιφάνειες προσδενόταν σε αυτές ομοιοπολικά παράγωγα της βιοτίνης ή άλλα μόρια που έφεραν ομάδες κατάλληλες για μετέπειτα χημεία «κλικ». Μελετήθηκε σε κάθε περίπτωση η επιτυχής ακινητοποίηση των μορίων μέσω χημείας <<κλικ>> στις τροποποιημένες επιφάνειες μέσω αντίδρασης με κατάλληλη φθορίζουσα ουσία που έφερε συμπληρωματική προς το υπόστρωμα ομάδα χημείας «κλικ». Χρησιμοποιήθηκε η φωτοχημεία αζιδίων, αξοιοποιώντας την χαρακτηριστική ιδιότητά τους ότι κατά την έκθεση στο βαθύ υπεριώδες (254 nm) ελευθερώνεται Ν2 παράγοντας νιτρένια, τα οποία στη συνέχεια αντιδρούν με τον διπλό δεσμό των πολυμερικών αλυσίδων δρώντας ως διασταυρωτές. Από την άλλη πλευρά, η χημεία «κλικ» επιλέχτηκε καθώς οι αντιδράσεις «κλικ» χαρακτηρίζονται από πολύ υψηλές αποδόσεις, απλότητα στην εφαρμογή και είναι στερεοειδικές.Επιπλέον, μελετήθηκε ένα λιθογραφικό σχήμα για διευθέτηση βιομορίων που βασίζεται στη χρήση φωτοπολυμερους που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε βιοσυμβατές συνθήκες. Στην εργασία αυτή διερευνήθηκε η δυνατότητα χρήσης και επέκτασης της ίδιας προσέγγισης για κατασκευή μικροσυστοιχιών από διαφορετικές πρωτεΐνες.