Βιοχημική και κυτταρική in vitro και in vivo προσέγγιση της αντικαρκινικής δράσης του θειωμένου υαλουρονικού στον καρκίνο του μαστού

Abstract

Breast cancer is one of the most prevalent malignancies worldwide, with disease progression largely depending on the expression of estrogen receptors (ERs), while the expression of extracellular matrix (ECM) molecules also plays a critical role. Hyaluronan (HA), a major component of the ECM, is involved in a plethora of physiological and pathological processes. Unlike other glycosaminoglycans, HA does not bear any substitutions to its structure naturally. However, recent studies highlight the use of chemically modified HA derivatives, such as sulfated hyaluronan (sHA), in applications including bio-scaffold manufacturing, wound healing, osteogenesis, and disease targeting. In the present PhD thesis, the effects of sHA on breast cancer cells of different ER status were studied. To this end, high-sulfated sHA was synthesized and its in vitro activity was evaluated on the breast cancer cell lines MCF-7, MDA-MB-231, Hs578T, and the stably transfected shERβ MDA-MB-231. Subsequently, three-dimensional in vitro cell culture models were developed and the effect of sHA was investigated under conditions that better reflect the tumor microenvironment. Moreover, the effect of sHA was studied in vivo in immunodeficient mice. Finally, the mechanism of action was investigated by studying signaling pathways, in addition to in silico molecular docking studies to predict possible interactions with HA receptors and degradation enzymes. According to the results, sHA reduces proliferation, migration, and invasion in the aggressive breast cancer cells, while increasing cell adhesion. Additionally, changes in cell morphology towards a more epithelial phenotype are observed through the use of scanning electron microscopy. These changes are further corroborated by alterations in the expression of important ECM molecules, as well as markers of cancer progression or suppression at the gene and protein level. Moreover, sHA reduces the tumorigenic capacity of breast cancer cells in immunodeficient mice. Overall, sHA demonstrates more potent antitumor activity compared to HA of the same molecular weight in both conventional and 3D cell cultures. This activity is primarily mediated through its main receptor, CD44, and partially attributed to competition with endogenously produced HA. In conclusion, the present thesis highlights the suppressive role of sHA in breast cancer, particularly in triple-negative breast cancer, thus marking it as a promising biomolecule in the development of innovative therapeutic approaches.

Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί μία από τις επικρατέστερες κακοήθειες παγκοσμίως, με την εξέλιξη της νόσου να εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την έκφραση των οιστρογονοϋποδοχέων (ERs), ενώ σημαίνοντα ρόλο παίζει και η έκφραση μορίων του εξωκυττάριου χώρου (ECM). Το υαλουρονικό (ΗΑ) αποτελεί ένα κύριο συστατικό του ECM και εμπλέκεται σε πλήθος φυσιολογικών και παθολογικών διεργασιών. Σε αντίθεση με τις υπόλοιπες γλυκοζαμινογλυκάνες, το ΗΑ δε φέρει υποκαταστάσεις στη δομή του φυσικά. Εντούτοις, πρόσφατες μελέτες αναδεικνύουν τη χρήση χημικά τροποποιημένων παραγώγων του ΗΑ, όπως το θειωμένο υαλουρονικό (sHA), σε εφαρμογές όπως η κατασκευή βιο-ικριωμάτων, η επούλωση πληγών, η οστεογένεση, καθώς και στη στόχευση ασθενειών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η δράση του sHA σε κύτταρα καρκίνου του μαστού διαφορετικής έκφρασης ERs. Για το σκοπό αυτό, συντέθηκε sΗΑ υψηλού βαθμού θείωσης και μελετήθηκε η in vitro δράση του στις καρκινικές σειρές MCF-7, MDA-MB-231, Hs578T, καθώς και στη σταθερά διαμολυσμένη σειρά shERβ MDA-MB-231. Παράλληλα, αναπτύχθηκαν τρισδιάστατα μοντέλα in vitro κυτταρικών καλλιεργειών και διερευνήθηκε η επίδραση του sHA σε καταστάσεις που προσομοιάζουν εγγύτερα το μικροπεριβάλλον του όγκου. Ακολούθως, μελετήθηκε η επίδραση του sHA in vivo σε μοντέλα ανοσοκατεσταλμένων μυών. Τέλος, διερευνήθηκε ο πιθανός μηχανισμός δράσης του sHA μέσω μελέτης σηματοδοτικών μονοπατιών και πραγματοποιήθηκαν in silico μελέτες μοριακής πρόσδεσης ώστε να προβλεφθούν οι πιθανές αλληλεπιδράσεις με υποδοχείς και ένζυμα αποικοδόμησης του ΗΑ. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, το sHA μειώνει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη διήθηση στα πιο επιθετικά καρκινικά κύτταρα μαστού, ενώ αυξάνει την κυτταρική προσκόλληση. Επιπλέον, με χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης παρατηρούνται αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων προς έναν πιο επιθηλιακό φαινότυπο. Οι αλλαγές αυτές επιβεβαιώνονται και από μεταβολές στην έκφραση σημαντικών μορίων του ECM καθώς και δεικτών προώθησης ή καταστολής του καρκίνου σε γονιδιακό και πρωτεϊνικό επίπεδο. Παράλληλα, το sHA μειώνει την ογκογενετική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων μαστού σε ανοσοκατεσταλμένους μύες. Συνολικά, το sHA παρουσιάζει αντικαρκινική δράση ισχυρότερη του ΗΑ ίδιου μοριακού βάρους, τόσο σε συμβατικές όσο και σε τρισδιάστατες κυτταρικές καλλιέργειες, με τη δράση αυτή να μεσολαβείται μέσω του κύριου υποδοχέα του, CD44, και να οφείλεται εν μέρει σε ανταγωνισμό με το ενδογενώς παραγόμενο HA. Συμπερασματικά, η παρούσα διατριβή αναδεικνύει την κατασταλτική δράση του sHA στον καρκίνο του μαστού, ιδιαίτερα στις πιο επιθετικές μορφές όπως ο μη ορμονοεξαρτώμενος τριπλά αρνητικός καρκίνος του μαστού, και το καθιστά ένα πολλά υποσχόμενο βιομόριο στην ανάπτυξη καινοτόμων θεραπευτικών προσεγγίσεων.