Investigation of 2-deoxyglucose (2DG) as a modulator of mesothelial and endothelial cell membrane function in peritoneal dialysis

Abstract

The Peritoneal Dialysis modality with the prolonged exposure to Peritoneal Dialysis Fluids (PDF) induce hyper-vascularization as well as peritoneal membrane thickening and fibrosis, ultimately leading to ultrafiltration failure. Therefore, there is intense scientific interest regarding the development of strategies that would delay the deterioration of the peritoneal membrane at a morphological and functional level. Recent evidence reported that mesothelial cells exposed to PDF with a high content in glucose degradation products (GDP) undergo metabolic reprogramming towards a more glycolytic phenotype associated with mesothelial-to-mesenchymal transition (MMT). However, addition of 2-deoxyglucose (2DG) inhibited the above process of MMT. In the present study, we investigated whether the 2DG effect is valid in mesothelial cells treated with low GDP PDF, and whether the same stands for endothelial cells as well. Furthermore, the effect of 2DG PDF supplementation was tested with regards to the mesothelial and endothelial barrier function. The antifibrotic effect of 2DG administration was confirmed through the collagen gel contraction assay with embedded mesothelial (MeT-5A) and endothelial (EA.hy926) cells cultured in Dianeal® 2.5% glucose (CPDF), BicaVera® 2.3% glucose (BPDF) and Balance® 2.3% glucose (LPDF) with or without the addition of 0.2 mM 2DG. Similar findings were obtained by performing qPCR for the αSMA and CDH2 genes. More specifically, the contractility of both MeT-5A and EA926 cells incubated with CPDF/2DG solution was reduced, accompanied by fold changes in αSMA and CDH2 gene expression. In the case of EA.hy926 cells, αSMA gene expression was also reduced under LPDF/2DG incubation. Regarding the effect of 2DG on permeability characteristics of the mesothelial and/or endothelial cell monolayers, it was assessed by monitoring the transmembrane resistance (RTM), FITC-labelled dextran (10, 70kDa) diffusion as well as gene expression levels of CLDN1, CLDN2, CLDN-3, CLDN4, CLDN5, ZO1, SGLT1 and SGLT2. Overall, the addition of 2DG attenuated the PDF-induced perturbations in mesothelial and/or endothelial barrier function, as shown by RTM values, dextran transport rate, and gene expression levels of CLDN-1 to -5, ZO1, and SGLT2, while its effect was more evident in MeT-5A cell monolayers. Therefore, supplementation of all types of PDF with 2DG not only mitigates MMT but also improves the functional permeability characteristics of the mesothelial and endothelial barrier of peritoneal membrane.

Η Περιτοναϊκή Κάθαρσης μέσω της παρατεταμένης έκθεση στα Υγρά Περιτοναϊκής Κάθαρσης (ΥΠΚ) προκαλεί υπερ-αγγειογένεση και επάγει την ίνωση της περιτοναϊκής μεμβράνης, οδηγώντας τελικά σε απώλεια υπερδιήθησης. Ως εκ τούτου, υπάρχει έντονο επιστημονικό ενδιαφέρον σχετικά με την ανάπτυξη στρατηγικών που θα επιβραδύνουν την έκπτωση της περιτοναϊκής μεμβράνης τόσο σε μορφολογικό όσο και λειτουργικό επίπεδο. Πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν ότι τα μεσοθηλιακά κύτταρα που εκτίθενται σε ΥΠΚ υψηλής περιεκτικότητας σε προϊόντα αποικοδόμησης της γλυκόζης (ΠΑΓ) υπόκεινται μεταβολικό επαναπρογραμματισμό προς έναν πιο γλυκολυτικό φαινότυπο που σχετίζεται με τη μεσοθηλιακή-προς-μεσεγχυματική μετάβαση (ΜΜΜ) των κυττάρων. Ωστόσο, προσθήκη 2-δεοξυ-γλυκόζης (2DG) ανέστειλε την παραπάνω διαδικασία. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε εάν αυτή η δράση της 2DG εντοπίζεται και σε μεσοθηλιακά κύτταρα που εκτίθενται σε ΥΠΚ χαμηλής περιεκτικότητας σε ΠΑΓ, αλλά και εάν διατηρείται και στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Επιπλέον, εξετάστηκε εάν η προσθήκη της 2DG σε διαφορετικούς τύπους ΥΠΚ επιδρά στη διαπερατότητα του μεσοθηλιακού και ενδοθηλιακού φραγμούς της περιτοναϊκής μεμβράνης. Η αντιϊνωτική δράση της 2DG επιβεβαιώθηκε μέσω της δοκιμασίας συστολής γέλης κολλαγόνου με ενσωματωμένα μεσοθηλιακά (MeT-5A) και ενδοθηλιακά (EA.hy926) κύτταρα, τα οποία καλλιεργήθηκαν στα διαλύματα Dianeal® 2,5% γλυκόζη, BicaVera® 2,3% γλυκόζη και Balance® 2,3% γλυκόζη με ή χωρίς την προσθήκη 0,2mM 2DG. Ανάλογα ευρήματα προέκυψαν και από τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων αSMA και CDH2 για τα οποία εφαρμόστηκε ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο. Πιο συγκεκριμένα, η συσταλτότητα τόσο των MeT-5A όσο και των EA.hy926 κυττάρων υπό την επίδραση του διαλύματος Dianeal®/2DG μειώθηκε, συνοδευόμενη από αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων αSMA και CDH2. Στην περίπτωση βέβαια των EA.hy926 κυττάρων, η έκφραση του γονιδίου αSMA μειώθηκε επίσης υπό την επίδραση του διαλύματος Balance®/2DG. Αναφορικά με τη δράση της 2DG στη διαπερατότητα κυτταρικών μονοστιβάδων, εκτιμήθηκε μέσω καταγραφής της διαμεμβρανικής αντίστασης (RTM), της παρακυτταρικής μεταφοράς φθορίζουσας δεξτράνης (10, 70kDa) καθώς και των επιπέδων γονιδιακής έκφρασης των CLDN1, CLDN2, CLDN3, CLDN4, CLDN5, ZO1, SGLT1 και SGLT2. Συνολικά, η προσθήκη 2DG μείωσε τις διαταραχές που επάγει στη λειτουργία του μεσοθηλιακού ή/και ενδοθηλιακού φραγμού η χρήση ΥΠΚ, όπως έδειξαν τα επίπεδα RTM, το ποσοστό μεταφοράς δεξτράνης και η έκφραση των γονιδίων CLDN-1 έως -5, ZO1 και SGLT2, με τη δράση της να είναι πιο εμφανής στις μονοστιβάδες MeT-5A κυττάρων. Συνεπώς, ο εμπλουτισμός όλων των τύπων ΥΠΚ με 2DG όχι μόνο μειώνει τη MMΜ αλλά επίσης βελτιώνει τα λειτουργικά χαρακτηριστικά της διαπερατότητας του μεσοθηλιακού και ενδοθηλιακού φραγμού της περιτοναϊκής μεμβράνης.