Περίληψη
Η πολυ(Α) εξειδικευμένη ριβονουκλεάση (PARN) είναι μια αποδενυλάση, ένας τελεστής της αποικοδόμησης του ευκαρυωτικού mRNA που μεσολαβεί στην ρύθμιση της σταθερότητας ποικίλων μη κωδικών RNA. Όπως είναι κοινό για τα περισσότερα γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, το γονίδιο της PARN κωδικοποιεί πολλαπλά εναλλακτικά μετάγραφα, τα οποία έχουν ανιχνευθεί από προηγούμες μελέτες αλληλούχισης. Τα εναλλακτικά μετάγραφα της PARN δεν έχουν χαρακτηριστεί βιοχημικά ή μελετηθεί ειδικά. Σε αυτή την εργασία ανιχνεύσαμε την έκφραση ενός εναλλακτικού μεταγράφου της PARN σε κυτταρικές σειρές κακοήθους μεσοθηλιώματος υπεζωκότα (PMM) και ινοβλάστες πνεύμονα, το εναλλακτικό μετάγραφο PARN_v1, συνεκφράζεται με την PARN στις κυτταρικές σειρές μεσοθηλιώματος αλλά όχι στους πνευμονικούς ινοβλάστες. H PARN_v1 εκφράζεται σε επίπεδο mRNA και σε επίπεδο πρωτεΐνης, σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται και από τους τρεις υποτύπους κακοήθους μεσοθηλιώματος του υπεζωκότα, ενώ είναι μη ανιχνεύσιμη σε καλοήθη υπεζω ...
Η πολυ(Α) εξειδικευμένη ριβονουκλεάση (PARN) είναι μια αποδενυλάση, ένας τελεστής της αποικοδόμησης του ευκαρυωτικού mRNA που μεσολαβεί στην ρύθμιση της σταθερότητας ποικίλων μη κωδικών RNA. Όπως είναι κοινό για τα περισσότερα γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, το γονίδιο της PARN κωδικοποιεί πολλαπλά εναλλακτικά μετάγραφα, τα οποία έχουν ανιχνευθεί από προηγούμες μελέτες αλληλούχισης. Τα εναλλακτικά μετάγραφα της PARN δεν έχουν χαρακτηριστεί βιοχημικά ή μελετηθεί ειδικά. Σε αυτή την εργασία ανιχνεύσαμε την έκφραση ενός εναλλακτικού μεταγράφου της PARN σε κυτταρικές σειρές κακοήθους μεσοθηλιώματος υπεζωκότα (PMM) και ινοβλάστες πνεύμονα, το εναλλακτικό μετάγραφο PARN_v1, συνεκφράζεται με την PARN στις κυτταρικές σειρές μεσοθηλιώματος αλλά όχι στους πνευμονικούς ινοβλάστες. H PARN_v1 εκφράζεται σε επίπεδο mRNA και σε επίπεδο πρωτεΐνης, σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται και από τους τρεις υποτύπους κακοήθους μεσοθηλιώματος του υπεζωκότα, ενώ είναι μη ανιχνεύσιμη σε καλοήθη υπεζωκοτικά αθανατοποιημένα κύτταρα. Τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης ανιχνεύθηκαν στους πνευμονικούς ινοβλάστες. Η κωδική περιοχή της PARN_v1 ταυτοποιήθηκε, κλωνοποιήθηκε, υπερεκφράσθηκε και χαρακτηρίστηκε βιοχημικά το πρωτεϊνικό του προϊόν. Η κλωνοποίηση και η ανάλυση αλληλουχίας της έδειξαν ότι σε σύγκριση με το mRNA της PARN η PARN_ν1 υστερεί κατά 83 βάσεων από το 3' άκρο του εξονίου 1, αυτή η περιοχή περιλαμβάνει το αρχικό κωδικόνιο έναρξης του PARN, οδηγώντας έτσι τη μετάφραση της PARN_v1 από ένα καθοδικό κωδικονίου έναρξης που βρίσκεται στο εξόνιο 4. Η πρωτεΐνη που προκύπτει στερείται μιας μεγάλης περιοχής 61aa της αρχικής περιοχής νουκλεάσης PARN, συμπεριλαμβανομένων δύο από τα κύρια καταλυτικά υπολείμματα D28 και D30. Το καθαρισμένο πρωτεινικό προιόν της PARN_ν1 διατηρεί την ικανότητά της να αποαδενυλιώνεται πιθανώς μέσω της στερικής υποκατάστασης των D28 και D30 από D292 και E378 αντίστοιχα. Για να εξεταστεί ο βιολογικός ρόλος της PARN_v1, πραγματοποιήθηκε η σίγησή της στους πνευμονικούς ινοβλάστες και υποβλήθηκε σε φασματομετρία μάζας, αποκαλύπτοντας τον ρόλο του στην κυτταρική προσκόλληση και στις αλληλεπιδράσεις των κυττάρων με την εξωκυττάρια ουσία. Μετά τη διαφοροποίηση των ινοβλαστών σε καρκικικούς ινοβλάστες με την επώασή τους με μέσο κυτταροκαλλιέργειας από κύτταρα καρκίνου του μαστού, αλλά και εξωσωμάτων που προέρχονται από κύτταρα καρκίνου του μαστού, τα επίπεδα PARN_v1 μειώθηκαν σημαντικά και η έκφραση PARN ενεργοποιήθηκε. Τέλος, αναπτύχθηκε ένα πρωτόκολλο απομόνωσης εξωσωμάτων για τη γρήγορη ανίχνευση εξωσωματικών βιοδεικτών RNA στο υπεζωκοτικό υγρό.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Poly(A)-specific ribonuclease (PARN) is a deadenylase, an effector of eukariotic mRNA decay that also mediates the maturation of a diverse and expanding repertoire of non-coding RNAs. Not unlike most protein coding genes, PARN encodes for multiple splice variants many, of which have been detected previously by RNA sequencing. Such splice variants have not been biochemically characterized or studied specifically in any context. In this work we detected the expression of a PARN splice variant in pleural malignant mesothelioma (PMM) cell lines and lung fibroblasts, the splice variant is co-expressed along with PARN in the PMM cell lines but not in lung fibroblasts. Our findings reveal that the splice variant is expressed at both the mRNA and protein level, in cell lines derived from all three pleural malignant mesothelioma subtypes, whilst being barely detectable in benign pleural immortalized cells, the highest expression levels were detected in lung fibroblasts. We identified and clo ...
Poly(A)-specific ribonuclease (PARN) is a deadenylase, an effector of eukariotic mRNA decay that also mediates the maturation of a diverse and expanding repertoire of non-coding RNAs. Not unlike most protein coding genes, PARN encodes for multiple splice variants many, of which have been detected previously by RNA sequencing. Such splice variants have not been biochemically characterized or studied specifically in any context. In this work we detected the expression of a PARN splice variant in pleural malignant mesothelioma (PMM) cell lines and lung fibroblasts, the splice variant is co-expressed along with PARN in the PMM cell lines but not in lung fibroblasts. Our findings reveal that the splice variant is expressed at both the mRNA and protein level, in cell lines derived from all three pleural malignant mesothelioma subtypes, whilst being barely detectable in benign pleural immortalized cells, the highest expression levels were detected in lung fibroblasts. We identified and cloned its coding region and subsequently overexpressed, purified and biochemically characterized its protein product. Additionally the splice variant wa Cloning and sequence analysis revealed that compared to PARN mRNA it lacks 83 bases from the 3’ end of exon 1, this spliced out region includes the original start codon of PARN, leading PARN_v1 to be translated through a downstream start codon located at exon 4. The resulting protein lacks a large 61aa region of the original PARN nuclease domain, including two of the main catalytic residues D28 and D30. Unexpectedly the novel protein was found to retain its ability to deadenylate possibly through the steric substitution of D28 and D30 by D292 and E378 respectively. To examine the biological role of PARN_v1, it was silenced in lung fibroblasts and subjected to mass spectrometry, revealing its role in cell adhesion and cell-ECM interactions. Upon fibroblast differentiation to cancer associated fibroblasts by the incubation of fibroblasts with breast cancer cell cultured media and breast cancer cell derived exosomes, the PARN_v1 levels serverely diminished and PARN expression was activated. Finally we developed an exosome isolation protocol for the quick detection of established exosomal RNA biomarkers in pleural fluid.
περισσότερα