Μορφοδυναμική ανάλυση των κυτταρικών συνδέσεων κατά την ανάπτυξη της Δροσόφιλα

Abstract

My thesis is focused on the role of integrin-linked kinase (ILK) during the morphogenetic process of egg chamber elongation in Drosophila. In order to study primarily the role of ILK and secondary the role of Parvin, as cental components of integrin adhesome we followed the following methodology: a) create ILK deficiency conditions in egg chambers either through genetic ablation of Ilk gene with the FRT/FLP or GAL4/UAS-FLP systems either through ILK knockdown by RNA interference, b) create Parvin deficiency conditions in egg chambers through the FRT/FLP system. The techniques we used were mostly a) immunofluorescent assays or b) live imaging techniques of egg chambers during rotation or during actomyosin oscillations in order to create and analyze timelapse series. Firstly, I analyzed the expression levels of βPS integrin, ILK, Parvin, PINCH and Talin in follicle epithelial cells during oogenesis. The expression levels of these processes are increased as the egg chamber develops and they are localized at the terminals of actin stress fibers. Only βPS is localized not only at the terminals of actin stress fibers but it is distributed all around the plasma membrane. Then, I examined if ILK is implicated in the process of egg chamber rotation. The analysis of rotation velocity showed that ILK is not required for egg chamber rotation, as the egg chambers where ILK knockdown was induced rotated with similar velocity to the wild type egg chambers. However, ILK is implicated in the morphogenetic process of actomyosin oscillations. The analysis showed that non-muscle myosin II and actin oscillated faster and with decreased intensity in in absence of ILK. Moreover, Ilk-/- cells showed increased levels of phosphorylated non-muscle myosin II. At the same time, the plasma membrane periphery in Ilk-/- cells is smaller and displays increased fluctuations. Thus, we concluded that ILK acts as regulator of the contractility state of follicle epithelial cells. Also, in absence of ILK actin organization is completely abolished Similar phenotypes for actin were observed in mosaic egg chambers for Parvin too. Besides actin’s organization, the organization of plasma membrane in the basal side of follicle cells is also affected. In egg chambers genetic mosaics for Ilk and Parvin the plasma membrane and the βPS-GFP has expanded width. Laminin also displays a broader distribution around the plasma membrane. The plasma membrane also generated lamellipodia towards random directions and performed fast and wavy movements. The defects in βPS organization and the unusual movements of plasma membrane led to the analysis of βPS-GFP mobility by FRAP assays in egg chambers genetic mosaics for Ilk and Parvin. Although, we expected increased mobility in βPS-GFP we obtained the opposite result since the mobile fraction of βPS-GFP is decreased. The above results indicate that ILK and Parvin cooperate with integrins and they regulate their organization and their mobility in plasma membrane. Finally, ILK plays a key role in collective cell movement. In the middle to the later oogenesis stages follicle cells migrate towards the anterior site of the egg chamber. In egg chambers genetic mosaics for Ilk in Ilk-/- cells these migratory movements take place with fast and random movements of plasma membrane and of lamellipodia. The measurement of migration velocity showed that Ilk-/- cells, despite their random movement, migrate faster than wild type cells. It is the first time such an observation is reported and sets the foundations for a new round of experiments.

Η διδακτορική μου διατριβή επικεντρώνεται στο ρόλο της ιντεγκρινο-συνδεόμενης κινάσης (ILK) κατά τη μορφογενετική διαδικασία της επιμήκυνσης του ωοθαλάμου στη Drosophila. Προκειμένου να μελετήσουμε κυρίως το ρόλο της ILK και έπειτα το ρόλο της Parvin, ως κεντρικά μέλη του ιντεγκρινικού συνδεοσώματος, ακολουθήσαμε την εξής μεθοδολογία: α) δημιουργία συνθηκών έλλειψης της ILK στο ωοθυλακικό επιθήλιο είτε μέσω γενετικής απαλοιφής της ILK με το σύστημα FRT/FLP ή GAL4/UAS-FLP είτε μέσω αποσιώπησης της έκφρασης της ILK μέσω RNA παρεμβολής (RNA interference), β) δημιουργία συνθηκών έλλειψης της Parvin στο ωοθυλακικό επιθήλιο μέσω γενετικής απαλοιφής της Parvin με το σύστημα FRT/FLP. Οι τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν κυρίως ήταν: α) ανοσοφθορισμός ή β) ζωντανή απεικόνιση των ωοθαλάμων είτε κατά την περιστροφή είτε κατά το φαινόμενο των ταλαντώσεων της ακτομυοσίνης με σκοπό τη δημιουργία και την ανάλυση αυτών των εικονοσειρών. Αρχικά ανέλυσα τα επίπεδα έκφρασης και τον εντοπισμό της β ιντεγκρίνης (βPS), της ILK, της Parvin, της PINCH και της Talin στα ωοθυλακικά κύτταρα κατά την ωογένεση. Τα επίπεδα των πρωτεϊνών αυτών αυξάνονται καθώς αναπτύσσεται ο ωοθάλαμος και εντοπίζονται κυρίως στις απολήξεις των ινιδίων τάσης της ακτίνης εκτός από την βPS η οποία εντοπίζεται σε όλο το μήκος της πλασματικής μεμβράνης. Στη συνέχεια εξέτασα αν η ILK εμπλέκεται στην περιστροφή των ωοθαλάμων. Από την ανάλυση της ταχύτητας της περιστροφής προέκυψε πως η ILK δεν διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της περιστροφής των ωοθαλάμων αφού οι ωοθάλαμοι στους οποίους έγινε μειορύθμιση της ILK περιστρέφονται με παρόμοια ταχύτητα με αυτή των αγρίου τύπου ωοθαλάμων. Ωστόσο, η ILK επηρεάζει τη μορφογενετική διαδικασία των περιοδικών ταλαντώσεων της ακτομυοσίνης. Η ανάλυση έδειξε πως η ταλάντωση των επιπέδων της μη-μυϊκής μυοσίνης ΙΙ και της ακτίνης γίνεται περισσότερο γρήγορα και με μικρότερη ένταση όταν απουσιάζει η ILK. Επιπλέον στα Ilk-/- κύτταρα βρέθηκαν αυξημένα τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης μη-μυϊκής μυοσίνης ΙΙ. Παράλληλα, το μήκος της πλασματικής μεμβράνης ήταν μειωμένο και η αυξομείωση του μήκους της πλασματικής μεμβράνης κατά τις παλμικές της κινήσεις ήταν μεγαλύτερη. Επομένως, κατά την απουσία της ILK τα κύτταρα γίνονται πιο συσταλτά υποδεικνύοντας πως η ILK στο ωοθυλακικό επιθήλιο δρα ως ρυθμιστικός παράγοντας της συσταλτικής κατάστασης των κυττάρων. Όταν απουσιάζει η ILK, η ακτίνη χάνει τελείως το αγρίου τύπου πρότυπο οργάνωσής της. Παρόμοιοι φαινότυποι για την ακτίνη παρουσιάστηκαν και σε ωοθαλάμους από τους οποίους απουσίαζε η Parvin. Εκτός από την ακτίνη, κατά την απουσία της ILK ή της Parvin επηρεάστηκε και η οργάνωση της πλασματικής μεμβράνης και της β υπομονάδας των ιντεγκρινών στη βασική πλευρά των ωοθυλακικών κυττάρων καθώς παρουσίασε αύξηση στο πλάτος της. Διευρυμένη εναπόθεση περιμετρικά της πλασματικής μεμβράνης παρουσίασε και η λαμινίνη, συστατικό της βασικής μεμβράνης, ενώ το κολλαγόνο έμεινε ανεπηρέαστο. Επιπλέον η πλασματική μεμβράνη, σχημάτιζε ελασματοπόδια προς τυχαίες κατευθύνσεις και πάλλονταν με ταχείες κυματοειδής κινήσεις. Η διαταραχή στην οργάνωση των ιντεγκρινών και στην κινητικότητα της πλασματικής μεμβράνης οδήγησε στην ανάλυση της κινητικότητας των ιντεγκρινών μέσω πειραμάτων FRAP σε ωοθαλάμους γενετικά μωσαϊκά για την ILK και για την Parvin. Αν και θα περιμέναμε η κινητικότητα των ιντεγκρινών να είναι αυξημένη κατά την απουσία της ILK ή της Parvin, κάτι τέτοιο δεν συνέβη καθώς το κινητικό κλάσμα των ιντεγκρινών εμφανίστηκε μειωμένο, υποδηλώνοντας περισσότερο σταθερή σύνδεση με τον κυτταροσκελετό της ακτίνης και στη βασική μεμβράνη. Τα παραπάνω δείχνουν πως η ILK και η Parvin συνεργάζονται στενά με τις ιντεγκρίνες και μάλιστα ρυθμίζουν την οργάνωση τους και την κινητικότητα τους στην πλασματική μεμβράνη. Τέλος, η ILK παίζει ρόλο στη συλλογική μεταναστευτική κίνηση των κυττάρων. Η μέτρηση της ταχύτητας της μετανάστευσης των ωοθυλακικών κυττάρων, κατά τη μετακίνησή τους προς το εμπρόσθιο τμήμα του ωοθαλάμου, έδειξε πως τα μεταλλαγμένα για την Ilk κύτταρα παρά την άτακτη κινητικότητά τους μεταναστεύουν πιο γρήγορα από τα αγρίου τύπου κύτταρα. Είναι η πρώτη φορά που αναδεικνύεται παρόμοιος ρόλος της ILK στη συλλογική μετακίνηση των κυττάρων, ανοίγοντας ένα νέο κεφάλαιο πειραμάτων.