Acquisition, retention, and transmission of Tobravirus particles by nematodes of the family Trichodoridae, and intervention of the trichodorid feeding behaviour and pharyngeal ultrastructure

Abstract

Different combinations of strains of pea early-browning and tobacco rattle Tobraviruses with selected Paratrichodorus and Trichodorus species were examined to identify if differences occurred in the location of virus particle retention within the nematodes. The study revealed that the sites of virus particle retention differed between the individual Tobravirus-trichodorid combinations. No differences were found in the sites of virus retention in nematodes that had been allowed to acquire, but not to transmit, virus compared with nematodes that had been allowed to acquire and subsequently transmit the virus. Virus particles of several strains of Tobraviruses were acquired and retained by trichodorids that are not natural vectors of the particular virus. In these instances the particles were retained within the pharyngeal tract at locations from where when released they are unable to be transferred anteriorly along the pharyngeal tract into plant cells, but rather they can move only posteriorly into the nematode intestine.

Γενικά: Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε σχεδόν εξ ολοκλήρου με τη χρήση ηλεκτρονιακού μικροσκοπίου διέλευσης, με διαρκή χρήση οπτικών μικροσκοπίων και στερεοσκοπίων, ενώ ένα μέρος της ολοκληρώθηκε με τη χρήση video – μικροσκοπίου. Στόχος της εργασίας ήταν η ανάλυση και επεξήγηση των φαινομένων που σχετίζονται με τη διαδικασία εξειδικευμένης μετάδοσης των φυτικών ιών Tobra από φυτοπαρασιτικούς νηματώδεις που ανήκουν στην οικογένεια Trichodoridae (γένη Trichodorus και Paratrichodorus). Πρόκειται για μία αναλυτική μελέτη του φαινομένου, ιδιαίτερα σε σχέση με τη διατροφική συμπεριφορά των συγκεκριμένων νηματωδών, καθώς και τη μικροδομή των στοματικών μορίων και του φαρυγγικού και οισοφαγικού τους σωλήνα. Περιγραφή του αντικειμένου έρευνας: Το γένος των ιών Tobra περιλαμβάνει τους ιούς TRV (Tobacco Rattle Virus), PEBV (Pea Early-Browning Virus) και PRV (Pepper Ringspot Virus), οι οποίοι μεταδίδονται στη φύση μέσω των προαναφερθέντων νηματωδών. Τόσο οι ιοί αυτοί όσο και οι φορείς τους είναι ιδιαίτερα διαδεδομένοι στην Ευρώπη, ενώ κρούσματα έχουν εντοπισθεί και στην Ελλάδα. Οι ιοί Tobra προξενούν ασθένειες υψηλής οικονομικής σημασίας σε διάφορα είδη φυτών ξενιστών, όπως πατάτα, καπνό, λεγκουμινώδη, βολβώδη κ.α. Επίσης, οι νηματώδεις Trichodoridae παρουσιάζουν μεγάλο φάσμα ξενιστών προσβάλλοντας είδη φυτών από όλες τις φυτικές οικογένειες. Η μεταδοτικότητα των ιών Tobra μέσω των φορέων τους, ελέγχεται από το RNA2 του ιικού γενώματος (οι ιοί Tobra φέρουν γενετικό υλικό που αποτελείται από δύο μονές αλυσίδες RNA, το μεγαλύτερο RNA1 και το μικρότερο RNA2), και συγκεκριμένα από τα γονίδια που κωδικοποιούν την καψιδιακή πρωτεϊνη και μία έως τρεις μη δομικές πρωτεΐνες ανάλογα με τη δεδομένη ιική σειρά. Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η κατανόηση και διαλεύκανση της διαδικασίας της φυσικής μετάδοσης των ιών Tobra από τους νηματώδεις Trichodoridae, με απώτερο στόχο την επιτυχέστερη καταπολέμησή τους, καθώς όπως είναι γνωστό, η καταπολέμηση των φυτικών ιών αποτελεί ένα από τα μεγαλύτερα προβλήματα των καλλιεργειών. Οι απαντήσεις που δόθηκαν είναι ιδιαίτερα χρήσιμες για το σχεδιασμό μεθόδων παρεμπόδισης της εξάπλωσης φυτικών ιώσεων στη φύση. Οι μέθοδοι αυτές μπορούν επιπλέον να είναι φιλικές προς το περιβάλλον, αντίθετα από τις μέχρι σήμερα εφαρμοζόμενες (π.χ. εφαρμογή χημικών νηματωδοκτόνων και ειδικά του βρωμιούχου μεθυλίου, η εφαρμογή του οποίου απαγορεύεται από την 1η Ιανουαρίου του 2005, λόγω της υψηλής τοξικότητάς του). Περιγραφή του πειραματικού μέρους και αποτελέσματα: Κατά τη διάρκεια αυτής της εργασίας μελετήθηκαν, μέσω ηλεκτρονιακής μικροσκοπίας διέλευσης, άτομα νηματωδών τα οποία ήταν ήδη γνωστό ότι έφεραν ιοσωμάτια στο εσωτερικό τους. Οι διάφορες τεχνικές εφαρμόστηκαν στη συνέχεια σε ποικιλία συνδυασμών ιικών απομονώσεων με νηματώδεις φορείς, καθώς και σε μη συμβατούς συνδυασμούς με νηματώδεις μη-φορείς. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο JEOL έδειξε ότι η θέση επίσχεσης των ιοσωματίων μέσα στο σώμα των φορέων τους εντοπίζεται γενικότερα στον φαρυγγικό και οισοφαγικό σωλήνα των νηματωδών, ενώ οι ειδικές θέσεις επίσχεσης για κάθε συγκεκριμένο είδος νηματώδη μπορεί να διαφέρουν ανάλογα με τον συγκεκριμένο εξεταζόμενο συνδυασμό ιού-νηματώδη. Επίσης αποδείχτηκε ότι η μετάδοση των ιών αυτών εξαρτάται κατά μεγάλο ποσοστό και από την ικανότητα απελευθέρωσης των ιοσωματίων από το νηματώδη στους φυτικούς ιστούς. Για παράδειγμα, για πρώτη φορά ανιχνεύτηκαν σωματίδια ιού στον οισοφάγο νηματωδών μη-φορέων της συγκεκριμένης ιικής απομόνωσης, αλλά σε θέσεις από τις οποίες ήταν αδύνατη η απελευθέρωσή τους από το νηματώδη προς το φυτό ξενιστή, ενώ η μόνη διέξοδος που είχαν ήταν προς τον εντερικό σωλήνα. Κατά τη διάρκεια της παρούσας μελέτης αναπτύχθηκε μια νέα πειραματική μέθοδος προετοιμασίας δειγμάτων για παρατήρηση σε ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο διέλευσης που δεν χρησιμοποιεί τετροξείδιο του οσμίου ως προσηλωτικό μέσο, εφ’ όσον έχει βρεθεί ότι το χημικό αυτό παρεμποδίζει την εξειδικευμένη αναγνώριση αντιγόνων από αντισώματα. Έτσι για πρώτη φορά ήταν δυνατή η εφαρμογή της μεθόδου ανοσοσήμανσης με κολλοειδή χρυσό που επέτρεψε την αναμφίβολη πιστοποίηση της ταυτότητας των ιοσωματίων με τη χρησιμοποίηση αντισωμάτων που αναγνωρίζουν εξειδικευμένα μόνο τις πρωτεϊνες των συγκεκριμένων ιικών καψιδίων. Με την εφαρμογή μιας καινοτομικής μεθόδου video-μικροσκοπίας, που περιελάμβανε την ιδιοκατασκευή ειδικών μικροθαλάμων παρατήρησης, μελετήθηκαν σε πραγματικό χρόνο οι διατροφικές συνήθειες του νηματώδη Paratrichodorus anemones με σκοπό να διαλευκανθεί το πότε και πώς επιτυγχάνεται η μετάδοση του ιού TRV. Πιο αναλυτικά, μελετήθηκε η αλληλουχία των φάσεων κατά τη διάρκεια ενός διατροφικού κύκλου του νηματώδη. Έτσι, παρατηρήθηκε ότι κάτω από ειδικές συνθήκες, σε ορισμένες, αν και ελάχιστες περιπτώσεις, φυτικά κύτταρα στα οποία έχει επιτεθεί ένας ή και περισσότεροι νηματώδεις, είναι δυνατόν να παραμείνουν ζωντανά, οπότε οι συνθήκες που επικρατούν μέσα στα συγκεκριμένα κύτταρα επιτρέπουν πλέον την επιβίωση του ιού στο εσωτερικό του κυττάρου και την εν συνεχεία μόλυνση ολόκληρου του φυτού. Η διαδικασία αυτή, εκτός από την δημοσίευσή της σε επιστημονικό περιοδικό με κριτές, υπάρχει καταγεγραμμένη και σε μορφή video. Η παρούσα εργασία περιλαμβάνει επίσης μία λεπτομερή παρατήρηση και περιγραφή της μικροδομής του φάρυγγα και του οισοφάγου διαφόρων ειδών νηματωδών της οικογένειας Trichodoridae με την χρήση του ηλεκτρονιακού μικροσκοπίου διέλευσης. Η περιγραφή αυτή έγινε μέσω της εξέτασης διαδοχικών υπέρλεπτων εγκάρσιων τομών που ελήφθησαν από την περιοχή μεταξύ των ακρότατων στοματικών μορίων μέχρι του σημείου έναρξης του εντέρου. Σκοπός ήταν να εξηγηθεί το γιατί τα ιοσωμάτια φέρονται ειδικά σε αυτή την περιοχή και πώς η λειτουργία και δομή του οισοφάγου των νηματωδών και των αδένων του, εμπλέκονται στη διαδικασία προσρόφησης, επίσχεσης και απελευθέρωσης των ιοσωματίων. Παράλληλα με την τελευταία μελέτη, πραγματοποιήθηκε, μέσω του ηλεκτρονιακού μικροσκοπίου διέλευσης, λεπτομερής ανάλυση της μικροδομής της επιδερμίδας των νηματωδών Trichodoridae. Η μελέτη αυτή έδειξε ότι οι νηματώδεις της συγκεκριμένης οικογένειας μπορούν να χωριστούν σε τρεις ομάδες ανάλογα με τη δομή της επιδερμίδας τους. Τα αποτελέσματα αυτά φαίνεται να παίζουν μεγάλο ρόλο στη συστηματική κατάταξη των διάφορων γενών της Trichodoridae, ακόμα και σε σχέση με άλλα taxa νηματωδών, αν και είναι αμφίβολο το κατά πόσο μπορούν να χρησιμοποιηθούν στον διαχωρισμό και την ταυτοποίηση ειδών.