Comparison of in/ex vivo replication characteristics of different porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains

Abstract

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is one of the most devastating diseases causing huge economic losses in swine industry. Only in the US the losses reached $664 million in the year 2013. The disease is caused by the PRRS virus (PRRSV), which is a single-stranded positive RNA virus, classified in the Arteriviridae family. The virus affects pigs of all ages, resulting in reproductive failures in sows and gilts and respiratory disorders in piglets. A high genetic heterogeneity divided PRRSV into the European type 1 and the American type 2. The virus shows a high mutation rate and evolves rapidly, resulting in the appearance of new highly pathogenic variants of both genotypes in Europe, North America and Asia over the last decade. Specifically in Europe, highly pathogenic PRRSV strains with increased respiratory disorders and more severe clinical signs have emerged recently. Therefore, the main goal of the present thesis was to examine the pathogenesis of the newly emerged isolates and identify the factors that contribute to the increased virulence .In the first part of chapter 1, an introduction is given based on the current literature on virus history, taxonomy, heterogeneity, pathogenesis, immune response and vaccination. In the second part, a brief introduction on the history and the applications of explant culture systems is presented, and the histology and immune system of the respiratory mucosae. In chapter 2 the general aim of the thesis is stated, and the specific goals are presented. In chapter 3, the different clinical, virological, serological and tissue tropism outcome of two new PRRSV strains (13V091 and 13V117), isolated in 2013 from two different Belgian farms with enzootic respiratory problems shortly after weaning in the nursery, were compared with the Belgian strain 07V063 isolated in 2007. Full genome sequencing was performed to identify the origin of the new isolates. Twelve weeks-old pigs were inoculated intranasally (IN) with 13V091, 13V117 or 07V063 (9 pigs/group). At 10 days post inoculation (dpi), 4 animals from each group were euthanized and tissues were collected for pathology, virological and serological analysis. 13V091 infection resulted in the highest respiratory disease scores and longest period of fever. Gross lung lesions were more pronounced for 13V091 (13%) than for 13V117 (7%) and 07V063 (11%). The nasal shedding and viremia was also most extensive with 13V091. The 13V091-inoculated group showed the highest virus replication in conchae, tonsils and retropharyngeal lymph nodes. 13V117 infection resulted in the lowest virus replication in lymphoid tissues. 13V091 showed higher numbers of sialoadhesin- infected cells/mm2 in conchae, tonsils and spleen than 13V117 and 07V063. Neutralizing antibody response with 07V063 was stronger than with 13V091 and 13V117. In summary: (1) two new PRRSV strains designated 13V091 and 13V117 were isolated from pigs showing respiratory distress. Pathogenic and genetic studies showed that 13V091 is the most pathogenic type 1 subtype 1 strain isolated up till now inducing fever, breathing problems, high virus titers in nasal secretions, an increased percentage of lung lesions in young animals and an expanded cell tropism to Sn- cells in nasal mucosa and other lymphoid tissues. (2) Despite the fact that 13V117 and 07V063 show only eight amino acid differences, they showed contrasting clinical and virological outcomes. 13V117 was able to induce fever, high viremia, and respiratory problems at the early stages of infection and it was able to replicate in the nasal mucosa but not in the lymph nodes, whereas 07V063 showed only fever, a 10-fold lower viremia, low virus titers in nasal excretions, but higher virus titers in lymphoid tissues. The increased respiratory disorders compared to contemporary PRRSV isolates and the expanded cell tropism observed in the results of chapter 3 triggered us to study the virus replication kinetics in the nasal mucosa more extensively. Thus, in chapter 4.1, a new polarized nasal mucosa explant system was used to study the invasion of the low virulent subtype 1 PRRSV strain Lelystad (LV) and the highly virulent subtype 3 PRRSV strain Lena at the portal of entry. Different cell types of the monocytic lineage (alveolar macrophages (PAM), cultured blood monocytes and monocyte-derived dendritic cells (moDC)) were enclosed to examine replication kinetics of both strains in their putative target cells. At 0, 12, 24, 48 and 72 hours post inoculation (hpi), virus production was analyzed and the infected cells were quantified and identified. Differences in replication were not found in monocytes and moDC. Confocal microscopy demonstrated that for LV, almost all viral antigen positive cells were CD163+Sialoadhesin (Sn)+, which were mainly located in the lamina propria of the respiratory mucosa. In Lena-infected nasal mucosa, CD163+Sn+, CD163+Sn- and to a lesser extent CD163-Sn- monocytic subtypes were involved in infection. CD163+Sn- cells were mostly located within or in the proximity of the epithelium. In summary, we proposed a model for the different mechanisms of invasion that were observed between these two PRRSV strains in nasal mucosa. On the one hand, LV susceptibility was mainly restricted to CD163+Sn+ cells, which were located in the lamina propria. The small number of Sn+ cells (5.2/mm2) that are present within the epithelial cell layer likely does not allow LV to reach high levels of infection. Only 2.5 LV-infected cells/mm2 were observed at 72 hpi, all of them located in the lamina propria and the 97% of them had a CD163+Sn+ phenotype. On the other hand, Lena was found to replicate 10 to 100 times more efficiently than LV and appears to hijack both CD163+Sn+ and CD163+Sn- cells lying within or close to the epithelium in order to gain access to deeper parts of the mucosa. After 48 hpi, clusters of mainly CD163+Sn- Lena-infected cells were observed within or close to the epithelium and clusters of CD163+Sn+ cells were observed in the lamina propria. These clusters expanded at 72 hpi, and to a lesser extent than the other phenotypes, CD163-Sn- cells were also detected at the periphery of them. In chapter 4.2, the explant system was used to expand our research and study the replication characteristics in the nasal mucosa of four type 1 (LV, 07V063, 08VA, 13V091), three type 2 (VR2332, MN-184, VN) and two attenuated (MLV-DV, MLV-VR2332) PRRSV strains. After 72 hpi mean virus titers reached 104.5 to 4.8 TCID50/ml for LV and 08V204, 105.2 to 5.4 TCID50/ml for Lena and VR2332, and 105.8 to 6.3 TCID50/ml for 07V063, 13V091, MN-184 and VN strains, whereas attenuated strains remained around the detection limit (0.9 TCID50/ml). The mean number of PRRSV-positive cells/mm2 at 72 hpi was 1.1 and 1.3 for the attenuated strains and LV, 13.3 for 08VA, 23.5 and 29.3 for VR2332 and 07V063, 31.1 and 33.8 for 13V091 and Lena, and, 39.1 and 59.2 for MN-184 and VN respectively. All the LV and MLV-DV infected cells were Sn+, whereas all other strains also infected Sn- macrophages. In conclusion, (i) based on virus shedding in the respiratory explants, PRRSV strains can be categorized as poor (MLV-DV, MLV-VR2332, LV, 08VA), moderate (Lena, VR2332) and strong (07V063, 13V091, MN-184, VN) secretors, and (ii) based on the number of infected cells isolates can be categorized as low (MLV-DV, MLV-VR2332, LV), moderately (08VA, VR2332), highly (07V063, Lena, 13V091) and hyper (MN-184, VN) virulent in the nasal mucosa. Finally, a general discussion of the main findings of this thesis and the future perspectives are presented in chapter 5.

Το αναπαραγωγικό και αναπνευστικό σύνδρομο των χοίρων (PRRS) είναι μια από τις πιο καταστροφικές ασθένειες που προκαλεί τεράστιες οικονομικές απώλειες στη βιομηχανία των χοίρων. Μόνο στις ΗΠΑ οι απώλειες έφτασαν τα 664 εκατομμύρια δολάρια το έτος 2013. Η ασθένεια προκαλείται από τον ιό PRRS (PRRSV), ο οποίος είναι ένας μονόκλωνος θετικός ιός RNA, ταξινομημένος στην οικογένεια των Arteriviridae. Ο ιός προσβάλλει χοίρους όλων των ηλικιών, με αποτέλεσμα αναπαραγωγικές ανεπάρκειες σε χοιρομητέρες και θηλυκούς χοίρους και αναπνευστικές διαταραχές στα χοιρίδια. Μια υψηλή γενετική ετερογένεια διαίρεσε τον PRRSV στον ευρωπαϊκό τύπο 1 και τον αμερικανικό τύπο 2. Ο ιός εμφανίζει υψηλό ποσοστό μετάλλαξης και εξελίσσεται γρήγορα, με αποτέλεσμα την εμφάνιση νέων εξαιρετικά παθογόνων παραλλαγών και των δύο γονότυπων στην Ευρώπη, τη Βόρεια Αμερική και την Ασία κατά την τελευταία δεκαετία. Συγκεκριμένα στην Ευρώπη, πρόσφατα εμφανίστηκαν στελέχη PRRSV υψηλής παθογονικότητας με αυξημένες αναπνευστικές διαταραχές και πιο σοβαρά κλινικά σημεία. Ως εκ τούτου, κύριος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η εξέταση της παθογένειας των νεοεμφανισθέντων απομονώσεων και ο εντοπισμός των παραγόντων που συμβάλλουν στην αυξημένη λοιμογόνο δράση. Στο πρώτο μέρος του κεφαλαίου 1, γίνεται μια εισαγωγή με βάση την τρέχουσα βιβλιογραφία για το ιστορικό ιών, την ταξινόμηση, την ετερογένεια, την παθογένεση, την ανοσολογική απόκριση και τον εμβολιασμό. Στο δεύτερο μέρος, παρουσιάζεται μια σύντομη εισαγωγή για την ιστορία και τις εφαρμογές των συστημάτων καλλιέργειας μοσχευμάτων, καθώς και την ιστολογία και το ανοσοποιητικό σύστημα των αναπνευστικών βλεννογόνων. Στο κεφάλαιο 2 αναφέρεται ο γενικός στόχος της διπλωματικής εργασίας και παρουσιάζονται οι συγκεκριμένοι στόχοι. Στο κεφάλαιο 3, η διαφορετική κλινική, ιολογική, ορολογική και ιστική έκβαση τροπισμού δύο νέων στελεχών PRRSV (13V091 και 13V117), που απομονώθηκαν το 2013 από δύο διαφορετικά βελγικά αγροκτήματα με ενζωοτικά αναπνευστικά προβλήματα λίγο μετά τον απογαλακτισμό στο φυτώριο, συγκρίθηκαν με τα βελγικά στέλεχος 07V063 που απομονώθηκε το 2007. Πραγματοποιήθηκε πλήρης αλληλουχία γονιδιώματος για να προσδιοριστεί η προέλευση των νέων απομονώσεων. Χοίροι ηλικίας δώδεκα εβδομάδων εμβολιάστηκαν ενδορινικά (ΙΝ) με 13V091, 13V117 ή 07V063 (9 χοίροι/ομάδα). Στις 10 ημέρες μετά τον εμβολιασμό (dpi), 4 ζώα από κάθε ομάδα υποβλήθηκαν σε ευθανασία και συλλέχθηκαν ιστοί για παθολογική, ιολογική και ορολογική ανάλυση. Η λοίμωξη 13V091 είχε ως αποτέλεσμα τις υψηλότερες βαθμολογίες αναπνευστικής νόσου και τη μεγαλύτερη περίοδο πυρετού. Οι μικτές βλάβες στους πνεύμονες ήταν πιο έντονες για το 13V091 (13%) από ό,τι για το 13V117 (7%) και το 07V063 (11%). Η ρινική έκκριση και η ιαιμία ήταν επίσης πιο εκτεταμένες με το 13V091. Η ομάδα που εμβολιάστηκε με το στέλεχος 13V091 έδειξε τον υψηλότερο πολλαπλασιασμό του ιού σε κόγχες, αμυγδαλές και οπισθοφάρυγγα λεμφαδένες. Η λοίμωξη με το στέλεχος 13V117 είχε ως αποτέλεσμα τη χαμηλότερη αντιγραφή του ιού στους λεμφικούς ιστούς. Το 13V091 έδειξε υψηλότερους αριθμούς μολυσμένων με σιαλοαδεσίνη κυττάρων/mm2 σε κόγχες, αμυγδαλές και σπλήνα από το 13V117 και το 07V063. Η απόκριση εξουδετερωτικού αντισώματος με 07V063 ήταν ισχυρότερη από ό,τι με τα 13V091 και 13V117. Συνοπτικά: (1) δύο νέα στελέχη PRRSV που ονομάζονται 13V091 και 13V117 απομονώθηκαν από χοίρους που εμφάνιζαν αναπνευστική δυσχέρεια. Παθογόνες και γενετικές μελέτες έδειξαν ότι το 13V091 είναι το πιο παθογόνο στέλεχος τύπου 1 υποτύπου 1 που έχει απομονωθεί μέχρι τώρα προκαλώντας πυρετό, αναπνευστικά προβλήματα, υψηλούς τίτλους ιού στις ρινικές εκκρίσεις, αυξημένο ποσοστό πνευμονικών βλαβών σε νεαρά ζώα και διευρυμένο κυτταρικό τροπισμό σε Sn- κύτταρα στο ρινικό βλεννογόνο και σε άλλους λεμφικούς ιστούς. (2) Παρά το γεγονός ότι τα 13V117 και 07V063 εμφανίζουν μόνο οκτώ διαφορές αμινοξέων, εμφάνισαν αντίθετα κλινικά και ιολογικά αποτελέσματα. Το 13V117 μπόρεσε να προκαλέσει πυρετό, υψηλή ιαιμία και αναπνευστικά προβλήματα στα αρχικά στάδια της μόλυνσης και ήταν σε θέση να αναπαραχθεί στον ρινικό βλεννογόνο αλλά όχι στους λεμφαδένες, ενώ το 07V063 έδειξε μόνο πυρετό, 10 φορές χαμηλότερη ιαιμία, χαμηλή τίτλους ιού στις ρινικές εκκρίσεις, αλλά υψηλότερους τίτλους ιού στους λεμφικούς ιστούς. Οι αυξημένες αναπνευστικές διαταραχές σε σύγκριση με τις σύγχρονες απομονώσεις PRRSV και ο διευρυμένος κυτταρικός τροπισμός που παρατηρήθηκε στα αποτελέσματα του κεφαλαίου 3 μας ώθησαν να μελετήσουμε εκτενέστερα την κινητική αντιγραφής του ιού στον ρινικό βλεννογόνο. Έτσι, στο κεφάλαιο 4.1, χρησιμοποιήθηκε ένα νέο πολωμένο σύστημα μοσχευμάτων ρινικού βλεννογόνου για τη μελέτη της εισβολής του στελέχους Lelystad (LV) υποτύπου 1 PRRSV χαμηλής λοιμογόνου δράσης και του στελέχους Lena του υποτύπου 3 PRRSV υψηλής λοιμογόνου δράσης στην πύλη εισόδου. Διαφορετικοί τύποι κυττάρων της μονοκυτταρικής γενεαλογίας (κυψελιδικά μακροφάγα (PAM), καλλιεργημένα μονοκύτταρα αίματος και δενδριτικά κύτταρα προερχόμενα από μονοκύτταρα (moDC)) περιλήφθηκαν για να εξεταστούν οι κινητικές αντιγραφής και των δύο στελεχών στα υποτιθέμενα κύτταρα-στόχους τους. Στις 0, 12, 24, 48 και 72 ώρες μετά τον εμβολιασμό (hpi), η παραγωγή του ιού αναλύθηκε και τα μολυσμένα κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν και ταυτοποιήθηκαν. Διαφορές στην αντιγραφή δεν βρέθηκαν στα μονοκύτταρα και στο moDC. Η ομοεστιακή μικροσκοπία έδειξε ότι για την LV, σχεδόν όλα τα θετικά για το αντιγόνο ιικά κύτταρα ήταν CD163+Sialoadhesin (Sn)+, τα οποία εντοπίζονταν κυρίως στο lamina propria του αναπνευστικού βλεννογόνου. Στον ρινικό βλεννογόνο μολυσμένο με Λένα, οι μονοκυτταρικοί υποτύποι CD163+Sn+, CD163+Sn- και σε μικρότερο βαθμό CD163-Sn- ενεπλάκησαν στη μόλυνση. Τα κύτταρα CD163+Sn- βρίσκονταν κυρίως εντός ή κοντά στο επιθήλιο. Συνοπτικά, προτείναμε ένα μοντέλο για τους διαφορετικούς μηχανισμούς εισβολής που παρατηρήθηκαν μεταξύ αυτών των δύο στελεχών PRRSV στον ρινικό βλεννογόνο. Από τη μία πλευρά, η ευαισθησία του LV περιοριζόταν κυρίως στα κύτταρα CD163+Sn+, τα οποία βρίσκονταν στο lamina propria. Ο μικρός αριθμός κυττάρων Sn+ (5,2/mm2) που υπάρχουν εντός της επιθηλιακής κυτταρικής στιβάδας πιθανότατα δεν επιτρέπει στο LV να φτάσει σε υψηλά επίπεδα μόλυνσης. Μόνο 2,5 μολυσμένα με LV κύτταρα/mm2 παρατηρήθηκαν στους 72 hpi, όλα εντοπίζονται στο lamina propria και το 97% από αυτά είχαν φαινότυπο CD163+Sn+. Από την άλλη πλευρά, η Lena βρέθηκε να αναπαράγει 10 έως 100 φορές πιο αποτελεσματικά από το LV και φαίνεται να πειράζει τα κύτταρα CD163+Sn+ και CD163+Sn- που βρίσκονται μέσα ή κοντά στο επιθήλιο για να αποκτήσει πρόσβαση σε βαθύτερα μέρη του βλεννογόνου. Μετά από 48 hpi, συστάδες κυττάρων κυρίως μολυσμένων με CD163+Sn-Lena παρατηρήθηκαν εντός ή κοντά στο επιθήλιο και συστάδες κυττάρων CD163+Sn+ στο lamina propria. Αυτά τα συμπλέγματα επεκτάθηκαν στους 72 hpi και σε μικρότερο βαθμό από τους άλλους φαινοτύπους, ανιχνεύθηκαν κύτταρα CD163-Sn- στην περιφέρειά τους. Στο κεφάλαιο 4.2, το σύστημα μοσχευμάτων χρησιμοποιήθηκε για την επέκταση της έρευνάς μας και τη μελέτη των χαρακτηριστικών αντιγραφής στον ρινικό βλεννογόνο τεσσάρων τύπου 1 (LV, 07V063, 08VA, 13V091), τριών τύπου 2 (VR2332, MN-184, VN) και δύο εξασθενημένα (MLV-DV, MLV-VR2332) στελέχη PRRSV. Μετά από 72 hpi, οι μέσοι τίτλοι του ιού έφτασαν τα 104,5 έως 4,8 TCID50/ml για LV και 08V204, 105,2 έως 5,4 TCID50/ml για Lena και VR2332, και 105,8 έως 6,3 TCID50/ml για 078, 07V3, TCID50/ml για 070, 07N3, 07, 10, 10, 3, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 40 μετριασμένη στελέχη παρέμειναν γύρω από το όριο ανίχνευσης (0,9 TCID50/ml). Ο μέσος αριθμός θετικών σε PRRSV κυττάρων/mm2 στους 72 hpi ήταν 1,1 και 1,3 για τα εξασθενημένα στελέχη και LV, 13,3 για 08VA, 23,5 και 29,3 για VR2332 και 07V063, 31,1 και 33,29 και 33,10V και 33,1,9 και 33,1,9 και 33,1,9 και 31,5 και 1,5 και 1,5 για MN-184 και VN αντίστοιχα. Όλα τα μολυσμένα με LV και MLV-DV κύτταρα ήταν Sn+, ενώ όλα τα άλλα στελέχη μόλυναν επίσης Sn-μακροφάγους. Συμπερασματικά, (i) με βάση την αποβολή του ιού στα αναπνευστικά εκφυτεύματα, τα στελέχη PRRSV μπορούν να κατηγοριοποιηθούν ως φτωχά (MLV-DV, MLV-VR2332, LV, 08VA), μέτρια (Lena, VR2332) και ισχυρά (07V063, 13V091, MN -184, VN) εκκρίτες και (ii) με βάση τον αριθμό των μολυσμένων κυττάρων απομόνωσης μπορούν να κατηγοριοποιηθούν ως χαμηλά (MLV-DV, MLV-VR2332, LV), μέτρια (08VA, VR2332), υψηλά (07V063, Lena, 13V091 ) και υπερ (MN-184, VN) λοιμογόνος στον ρινικό βλεννογόνο. Τέλος, μια γενική συζήτηση για τα κύρια ευρήματα της παρούσας διατριβής και τις μελλοντικές προοπτικές παρουσιάζονται στο κεφάλαιο 5.