Ανάπτυξη μεθόδου αλληλούχισης γονιδίου για τη διερεύνηση οροτύπων Streptococcus pneumoniae απ' ευθείας σε κλινικά δείγματα

Abstract

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is one of the most frequent and common pathogens. A total of 1.6 million people worldwide die from pneumococcal diseases each year, of which approximately 700,000-1,000,000 are children under the age of 5. Children under the age of 5, the elderly, and those with an immune deficiency are considered to be at higher risk for pneumococcal infections. Streptococcus pneumoniae is responsible for a variety of infections: invasive, such as bacteremia, septicemia, meningitis, and the more common and clinically milder non-invasive, acute otitis media, sinusitis, and pharyngotonsillitis. The virulence of the microorganism is attributed to the antigenic structure of the polysaccharides of its capsule, on the basis of which it is divided into approximately 100 different serotypes. The increased frequency and the severity of invasive pneumococcal diseases are the main reasons why the epidemiological surveillance of pathogenic serotypes is considered imperative. Vaccination is important not only for prevention, but also due to the ever-increasing resistance to penicillin. The 13-valent pneumococcal conjugate vaccine (PCV-13) includes the serotypes of the 7-valent vaccine (4, 9V, 19F, 14, 23F, 18C, 6B) and additionally serotypes 1, 5, 7, 19A, 3, 6A. These vaccines cover only a few serotypes and are unable to protect against serotypes not present in the vaccine or strains that do not express capsular antigen. This has led to a rapid increase in non-vaccine serotypes, some of which are resistant to antibiotics. Therefore, there is an urgent need to develop new and effective pneumococcal vaccines that could cover a wide range of serotypes. Valid and timely diagnosis and characterization of the pneumococcus in terms of it’s serotypes is of critical importance. Tools for identifying the microorganism are classical culture, biochemical methods (optochin sensitivity test and solubility in bile salts, etc.) and serotyping. In recent years molecular techniques have brought about a real revolution as it becomes possible to detect the microorganism. The application of molecular methods (PCR) is crucial in the successful identification of the microorganisms causing infections in a significant proportion of culture-negative clinical samples attributed also to previous antibiotic treatment. Accurate diagnosis and identification of the pathogen is important for patient management and targeted antimicrobial therapy. The aim of the present study was, to create a technique based on the methods of polymerase chain reaction (PCR) and Sequencing, which has the possibility of detecting the serotypes of the microorganism Streptococcus pneumoniae from isolates as well as from biological materials – where the culture and isolation of the microorganism is not easy, the epidemiological investigation of the Streptococcus pneumoniae serotypes that cause the various infections and whether these serotypes have changed over the years. A new method - CST, formulated in two reaction steps, was developed and shown to have excellent performance on a wide range of applied biological materials. With the new method, the percentage of samples that a serotype can be attributed, rose to 92.8% from about 50% before the implementation of the new method. Also, with the completion of the serotyping of the non-typed samples, it became possible to retrospectively study Streptococcus pneumoniae serotypes in Greece for a long period of time, from 2010, after the introduction of the PCV-13 vaccine, until 2020.

Ο μικροοργανισμός Streptococcus pneumoniae (πνευμονιόκοκκος) είναι ένα από τα πιο συχνά και κοινά παθογόνα μικρόβια. Συνολικά κάθε χρόνο 1,6 εκατ. άνθρωποι στον κόσμο πεθαίνουν από ασθένειες που προκαλούνται από τον πνευμονιόκοκκο, από τους οποίους περίπου 700.000-1.000.000 είναι παιδιά κάτω των 5 ετών. Υψηλού κινδύνου για πνευμονιοκοκκικές λοιμώξεις θεωρούνται τα παιδιά κάτω των 5 ετών, τα άτομα τρίτης ηλικίας, καθώς και αυτά με ανοσιακό έλλειμμα. Πρόκειται για ένα Gram+ βακτήριο, που προκαλεί ένα ευρύ φάσμα κλινικών συμπτωμάτων, λόγω της άμεσης επέκτασης από το ρινοφάρυγγα ή της αιματογενούς διασποράς του. Η μετάδοση γίνεται μόνο από άνθρωπο σε άνθρωπο, με σταγονίδια κατά την ομιλία, το βήχα και τον πταρμό ή αυτοενοφθαλμισμό. Ο πνευμονιόκοκκος ευθύνεται για μια ποικιλία λοιμώξεων: διεισδυτικές, όπως βακτηριαιμία, σηψαιμία, μηνιγγίτιδα και τις πιο συχνές και κλινικά ηπιότερες μη διεισδυτικές, οξεία μέση ωτίτιδα, παραρρινοκολπίτιδα και φαρυγγοαμυγδαλίτιδα. Η λοιμογόνος δύναμη του βακτηρίου αποδίδεται στην αντιγονική δομή των πολυσακχαριτών της κάψας του, με βάση την οποία, χωρίζεται σε περίπου 100 διαφορετικούς ορότυπους. Η αυξημένη συχνότητα και η ιδιαίτερη βαρύτητα των διεισδυτικών και μη πνευμονιοκοκκικών νόσων αποτελούν τους κυριότερους λόγους για τους οποίους η επιδημιολογική επιτήρηση των παθογόνων οροτύπων κρίνεται επιβεβλημένη. Ο εμβολιασμός είναι σημαντικός όχι μόνο για λόγους πρόληψης, αλλά και λόγω της συνεχούς αυξανόμενης αντοχής στην πενικιλίνη. Το 13-δύναμο συζευγμένο πνευμονιοκοκκικό εμβόλιο (PCV-13) περιλαμβάνει τους ορότυπους του 7-δύναμου εμβολίου (4, 9V, 19F, 14, 23F, 18C, 6B) και επιπρόσθετα τους ορότυπους 1, 5, 7, 19Α, 3, 6Α. Όπως γίνεται άμεσα αντιληπτό, αυτά τα εμβόλια καλύπτουν μόνο μερικούς ορότυπους και δεν είναι σε θέση να προστατεύσουν από τους ορότυπους που δεν υπάρχουν στο εμβόλιο ή από στελέχη που δεν εκφράζουν καψιδικό αντιγόνο. Το γεγονός αυτό οδήγησε σε ταχεία αύξηση των μη εμβολιακών οροτύπων, κάποιοι από τους οποίους είναι ανθεκτικοί στα αντιβιοτικά. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη νέων και αποτελεσματικών εμβολίων για τον πνευμονιόκοκκο, τα οποία θα έχουν τη δυνατότητα να καλύψουν ένα ευρύ φάσμα ορότυπων. Από τα παραπάνω γίνεται εμφανές ότι η έγκυρη και έγκαιρη διάγνωση και τυποποίηση του πνευμονιοκόκκου ως προς τους οροτύπους του, είναι κριτικής σημασίας. Εργαλεία για αναγνώριση του μικροοργανισμού αποτελούν η κλασσική καλλιέργεια, οι βιοχημικές μέθοδοι (δοκιμασία ευαισθησίας στην οπτοχίνη, διαλυτότητα στα χολικά άλατα κτλ.) και η τυποποίηση. Τα τελευταία χρόνια οι μοριακές τεχνικές έφεραν μια πραγματική επανάσταση καθότι γίνεται δυνατή η ανίχνευση του μικροοργανισμού. Η εφαρμογή μοριακών μεθόδων (PCR) είναι ζωτικής σημασίας, στον επιτυχή εντοπισμό των μικροοργανισμών που προκαλούν λοιμώξεις, σε ένα σημαντικό ποσοστό των κλινικών δειγμάτων με αρνητική καλλιέργεια. Η ακριβής διάγνωση και η αναγνώριση του παθογόνου είναι σημαντική για την αντιμετώπιση του ασθενή και τη στοχευμένη αντιμικροβιακή θεραπεία. Προηγούμενη θεραπεία με αντιβιοτικά μπορεί, εν μέρει, να ευθύνεται για την παρατηρούμενη χαμηλή αποτελεσματικότητα των καλλιεργειών στην ανίχνευση του παθογόνου μικροοργανισμού. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν αφ’ ενός μεν η δημιουργία μιας τεχνικής που στηρίζεται στις μεθόδους της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) και της αλληλούχισης γενετικού υλικού (Sequencing), και η οποία να έχει τη δυνατότητα ανίχνευσης των οροτύπων του μικροοργανισμού Streptococcus pneumonie τόσο σε στελέχη όσο και σε βιολογικά υλικά – όπου η καλλιέργεια και απομόνωση του μικροοργανισμού δεν είναι εύκολη, αφ’ ετέρου, η επιδημιολογική διερεύνηση των οροτύπων του Streptococcus pneumonie που προκαλούν τις διάφορες λοιμώξεις και αν αυτοί οι ορότυποι έχουν αλλάξει με τη πάροδο των ετών. Αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος - CST, που διαμορφώθηκε σε δύο στάδια αντιδράσεων, και η οποία φάνηκε ότι έχει εξαιρετική απόδοση σε μια πληθώρα βιολογικών υλικών που εφαρμόστηκε. Με τη νέα μέθοδο, το ποσοστό των τυποποιημένων δειγμάτων ανήλθε στο 92,8% από περίπου 50% που ήταν πριν την εφαρμογή της νέας μεθόδου. Επίσης με την ολοκλήρωση της τυποποίησης των μη-τυποποιημένων δειγμάτων κατέστη δυνατή η αναδρομική μελέτη των οροτύπων Streptococcus pneumoniae στην Ελλάδα για ένα μεγάλο χρονικό διάστημα, από το 2010, μετά την εισαγωγή του εμβολίου PCV-13, εώς το 2020.