Investigation of the oncogenic role of the replication licensing factor CDC6 in prostate cancer

Abstract

Background: Prostate cancer is a hormone-dependent type of cancer that represents a leading cause of cancer morbidity and mortality in men around the world. Androgen deprivation therapy (ADT) remains the mainstay of therapy for patients with prostate cancer, but has proven efficient only in early-stage androgen-responsive disease state. Unfortunately, prostate cancer gradually progresses into an androgen-irresponsive and metastatic disease state for a great number of patients. Based on our previously presented oncogene-induced model for cancer progression, senescence has been established as a very important tumor-barrier mechanism. However, the implication of senescence in the progression of early-stage androgen-dependent to highly aggressive and metastatic castration-resistant prostate cancer (CRPC) should be further investigated. Materials & Methods: In this study we implemented androgen-responsive (LNCaP) and –irresponsive (C4-2B and PC-3) prostate cancer cells, treated or not with enzalutamide, an Androgen Receptor (AR) inhibitor. In order to identify potential senescence regulators upon treatment with enzalutamide we conducted RNA sequencing and pathway analyses in LNCaP cells to identify. Moreover, we continued with evaluation of the invasive potential of cells and senescence status upon AR signaling inhibition via enzalutamide and/or RNAi-mediated depletion of selected targets in all cell lines, accompanied by bioinformatics analyses on a broad range of in vitro and in vivo datasets. The most important findings were also confirmed in LNCaP and C4-2B mouse xenografts. Assessment of senescence status was performed using the state-of-the-art GL13 staining by immunocytochemical staining and confocal microscopy. Results: In this study we found that enzalutamide treatment promotes induction of senescence in androgen-dependent cells through downregulation of the replication licensing factor CDC6. Mechanistically, we show that enzalutamide in androgen-dependent cells activates the endogenous levels of GATA2 transcription factor, that functions as a CDC6 repressor, thus resulting in CDC6 downregulation. Intriguingly, in enzalutamide-resistant cells we observed a decrease in GATA2 levels, and a consequent CDC6 stabilization followed by enhanced activation of Epithelial-To-Mesenchymal Transition (EMT) markers and absence of senescence. We demonstrate that CDC6 depletion can converse the oncogenic status and establish senescence irrespective of treatment responsiveness, thereby highlighting the importance of CDC6 for the regulation of prostate cancer progression. Conclusions: We identify a crucial senescence-mediated GATA2-CDC6 signaling axis which is conversely regulated in enzalutamide-responsive and -irresponsive prostate cancer environments. Upon acquired resistance, GATA2 repression stabilizes CDC6, with harmful consequences in prostate cancer progression through EMT worsening and senescence abrogation. However, bypassing the GATA2-CDC6 axis by experimental silencing of CDC6 is sufficient to reverse oncogenic characteristics and induce senescence, offering a therapeutic window even upon acquiring therapy resistance.

Ερευνητικό Υπόβαθρο: Ο καρκίνος του προστάτη ανήκει στην οικογένεια των ορμονοεξαρτώμενων καρκίνων και αποτελεί κύρια αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας από καρκίνο στους άνδρες σε όλο τον κόσμο. Η θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT) παραμένει ο βασικός άξονας θεραπείας για ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, αλλά έχει αποδειχθεί αποτελεσματική μόνο σε πρώιμο στάδιο της νόσου όταν ακόμα ο καρκίνος ανταποκρίνεται στα ανδρογόνα. Δυστυχώς, σε μεγάλο αριθμό ασθενών ο καρκίνος του προστάτη εξελίσσεται σταδιακά σε μια μεταστατική κατάσταση ασθένειας που δεν ανταποκρίνεται στα ανδρογόνα. Με βάση το μοντέλο εξέλιξης του καρκίνου που προκαλείται από ογκογονίδιο, η γήρανση έχει καθιερωθεί ως ένας πολύ σημαντικός μηχανισμός φραγμού του όγκου. Ωστόσο, ο ρόλος της γήρανσης στην εξέλιξη του ανδρογονοεξαρτώμενου καρκίνου του προστάτη σε εξαιρετικά επιθετικό, μεταστατικό και ανθεκτικό στον ευνουχισμό καρκίνο (CRPC) θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω. Υλικά & Μέθοδοι: Σε αυτή την εργασία χρησιμοποιήσαμε καρκινικά κύτταρα του προστάτη που ανταποκρίνονται (LNCaP) και που δεν ανταποκρίνονται (C4-2B και PC-3) σε ανδρογόνα, στα οποία είτε χορηγήσαμε είτε όχι ενζαλουταμίδη (enzalutamide), η οποία αποτελεί αναστολέα του υποδοχέων ανδρογόνων (AR). Προκειμένου να εντοπιστούν πιθανοί ρυθμιστές γήρανσης κατά τη θεραπεία με ενζαλουταμίδη, πραγματοποιήσαμε στα LNCaP κύτταρα αναλύσεις τόσο αλληλουχίας RNA καθώς και μονοπατιών. Επιπλέον, συνεχίσαμε με την αξιολόγηση της δυνατότητας διήθησης των κυττάρων και της κατάστασης γήρανσης έπειτα χορήγηση ενζαλουταμίδης ή/και μετά την RNAi-αποσιώπηση επιλεγμένων στόχων σε όλες τις κυτταρικές σειρές, συνοδευόμενη από βιοπληροφορική ανάλυση σε ένα ευρύ φάσμα in vitro και in vivo δεδομένων. Τα πιο σημαντικά ευρήματα επιβεβαιώθηκαν επίσης σε ξενομοσχεύματα LNCaP και C4-2B ποντικών. Η αξιολόγηση της γήρανσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη χρώση τελευταίας τεχνολογίας GL13, με ανοσοκυτταροχημική χρώση καθώς και με συνεστιακή μικροσκοπία. Αποτελέσματα: Σε αυτή τη μελέτη βρήκαμε ότι η θεραπεία με ενζαλουταμίδη προάγει την επαγωγή γήρανσης σε εξαρτώμενα από ανδρογόνα καρκινικά κύτταρα προστάτη μέσω της μείωσης της ρύθμισης του παράγοντα αδειοδότησης αντιγραφής CDC6. Μηχανιστικά, δείχνουμε ότι η ενζαλουταμίδη σε εξαρτώμενα από ανδρογόνα κύτταρα ενεργοποιεί τα ενδογενή επίπεδα του μεταγραφικού παράγοντα GATA2, ο οποίος λειτουργεί ως καταστολέας του CDC6, με αποτέλεσμα τη μείωση της ρύθμισης του CDC6. Παραδόξως, στα ανθεκτικά στην ενζαλουταμίδη κύτταρα παρατηρήσαμε μείωση των επιπέδων του GATA2 και επακόλουθη σταθεροποίηση του CDC6 συνοδευόμενη από ενισχυμένη ενεργοποίηση ΕΜΤ (epithelial to mesenchymal transition) δεικτών και απουσία γήρανσης. Αποδεικνύουμε ότι η εξάλειψη του CDC6 μπορεί να αναστρέψει την κατάσταση του όγκου και να επάγει γήρανση ανεξάρτητα από την ανταπόκριση στη θεραπεία, υπογραμμίζοντας έτσι τη σημασία του CDC6 στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Συμπεράσματα: Σε αυτή τη μελέτη εντοπίσαμε τον κρίσιμο άξονα σηματοδότησης GATA2-CDC6, ο οποίος ρυθμίζεται αντίστροφα ανάλογα με την ανταπόκριση στην ενζαλουταμίδη. Όταν υπάρχει ανθεκτικότητα στην ενζαλουταμίδη, η καταστολή του GATA2 σταθεροποιεί το CDC6, με επιβλαβείς συνέπειες στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη μέσω επιδείνωσης του EMT και αποφυγής της γήρανσης. Ωστόσο, η παράκαμψη του άξονα GATA2-CDC6 με πειραματική σίγαση του CDC6 είναι αρκετή για την αναστροφή των ογκογόνων χαρακτηριστικών και την πρόκληση γήρανσης, προσφέροντας ένα θεραπευτικό παράθυρο ακόμη και μετά την απόκτηση ανθεκτικότητας στη θεραπεία.