Διερεύνηση του ρόλου των πολυμορφισμών στη λειτουργικότητα και στο μηχανισμό ρύθμισης του γονιδίου του υποδοχέα της βιταμίνης D (VDR) σε ασθενείς με κίρρωση του ήπατος

Abstract

Vitamin D binds to its receptor, the VDR (Vitamin D receptor), in order to carry out its biological function, which has been reported to be influenced by the presence of polymorphisms in the VDR gene. The presence of VDR polymorphisms has been correlated with chronic liver diseases. Four common single nucleotide polymorphisms, namely ApaI, BsmI, TaqI, and FokI, have been identified in the VDR gene. The prognostic significance of VDR polymorphisms has been highlighted in terms of disease severity and survival in patients with liver cirrhosis. Specifically, cirrhotic patients who carried the ApaI polymorphism were predominantly in Child-Pugh stage C and exhibited elevated levels of pro-inflammatory cytokines IL-1β and IL-8, as well as acute-phase protein LBP (Lipopolysaccharide binding protein). Cirrhotic patients carrying the BsmI and TaqI polymorphisms had increased MELD score and were predominantly in Child-Pugh stage C compared to those without the polymorphisms. The presence of the FokI polymorphism served as a prognostic indicator for increased survival in cirrhotic patients and was associated with low levels of pro-inflammatory cytokine IL-1β. The aim of this study was to clarify the potential mechanism through which VDR polymorphisms, namely ApaI, BsmI, TaqI, and FokI, affect the functionality of the VDR gene and subsequently contribute to the progression of fibrosis and the survival of patients with liver cirrhosis, regardless of etiology. Initially, genomic DNA was isolated from the whole blood of both cirrhotic patients and healthy controls. Subsequently, genotyping of the samples was performed using TaqMan SNP Genotyping Assays technology to determine the ApaI, BsmI, TaqI, and FokI polymorphisms. Isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from whole blood of healthy individuals and patients was performed using a Ficoll density gradient centrifugation method. These PBMCs were further phenotyped to determine the cellular subsets CD3+VDR+ and CD14+VDR+ using flow cytometry. The concentration of VDR in the plasma of healthy individuals and patients was quantified using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. Quantification of mRNA of genes, regulated by the signaling pathway of D-VDR, was performed using real-time PCR. Finally, molecular dynamics (MD) simulations were applied to study the different structures of the VDR protein and the interaction of D-VDR in the presence and absence (wild type) of the FokI polymorphism. Our results demonstrated a significant negative correlation between the levels of CD14+VDR+ cellular subset and the clinical severity index of the disease, MELD score. The presence of the ApaI polymorphism was associated with a significant decrease in the levels of CD3+VDR+ cells in cirrhotic patients. The presence of the FokI polymorphism was associated with a significant increase in the levels of CD3+VDR+ cells in both healthy individuals and cirrhotic patients. The presence of BsmI and TaqI VDR polymorphisms was associated with a significant increase in VDR protein concentration in the plasma. The presence of ApaI and BsmI VDR polymorphisms was associated with a significant increase in the expression of the Gpx gene in cirrhotic patients. The presence of BsmI and TaqI VDR polymorphisms was associated with a significant decrease in the expression of the PMCA gene. Moreover, the presence of the BsmI polymorphism was associated with a significant reduction in both the expression of the JMJD1A gene and liver stiffness levels in cirrhotic patients. Through MD simulations, it was observed that the FokI polymorphism yields a protein product with a binding domain containing five fewer amino acids in comparison to the wild-type conformation, specifically within the region that bridges the vitamin D binding domain and the DNA binding domain. In this study, the clinical severity of cirrhosis was correlated with VDR levels, and the presence of VDR polymorphisms in cirrhotic patients was significantly associated with VDR protein levels. Therefore, it can be hypothesized that polymorphisms in the VDR gene may be involved in the progression of cirrhosis by affecting VDR protein levels. The association between VDR polymorphisms and the expression of genes regulated by D-VDR activity, which are involved in important biological processes for hepatocyte function and immune responses, represents another potential point of contribution of VDR polymorphisms to the progression of cirrhosis. Lastly, the effect of the FokI polymorphism in the binding domain between the two interacting regions involved in VDR-DNA binding highlights the possibility of its influence on the functionality of the DNA binding domain, potentially affecting the transcriptional activity of the VDR receptor.

Η βιταμίνη D προσδένεται στον υποδοχέα της VDR (Vitamin D receptor), για να επιτελέσει τη βιολογική της λειτουργία, η οποία έχει αναφερθεί να επηρεάζεται από την παρουσία πολυμορφισμών στο γονίδιο του VDR. Η παρουσία των VDR πολυμορφισμών έχει συσχετιστεί με χρόνιες ηπατικές νόσους. Τέσσερις κοινοί πολυμορφισμοί, οι ApaI, BsmI, TaqI και FokI, έχουν προσδιοριστεί στο γονίδιο του VDR. Η προγνωστική σημασία των VDR πολυμορφισμών έχει αναδειχθεί στη σοβαρότητα της νόσου και στην επιβίωση σε ασθενείς με κίρρωση του ήπατος. Ειδικότερα, κιρρωτικοί ασθενείς, οι οποίοι ήταν φορείς του ApaI πολυμορφισμού ήταν κυρίως CP σταδίου C και είχαν αυξημένα επίπεδα προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών IL-1β και IL-8 και της πρωτεΐνης οξείας φάσης LBP (Lipopolysaccharide binding protein). Κιρρωτικοί ασθενείς που έφεραν τους BsmI και TaqI πολυμορφισμούς είχαν αυξημένο MELD σκορ και ήταν κυρίως CP σταδίου C σε σύγκριση με αυτούς που δεν είχαν τους πολυμορφισμούς. Η παρουσία του FokI πολυμορφισμού αποτέλεσε προγνωστικό δείκτη αυξημένης επιβίωσης στους κιρρωτικούς ασθενείς και συσχετίστηκε με χαμηλά επίπεδα προ-φλεγμονώδους κυτταροκίνης IL-1β. Στόχο της παρούσας μελέτης αποτέλεσε η διασαφήνιση του πιθανού μηχανισμού, μέσω του οποίου οι VDR πολυμορφισμοί ApaI, BsmI, TaqI και FokI επηρεάζουν την λειτουργικότητα του VDR γονιδίου και επακόλουθα την εξέλιξη της ίνωσης και την επιβίωση των ασθενών με κίρρωση του ήπατος ανεξαρτήτου αιτιολογίας. Αρχικά πραγματοποιήθηκε η απομόνωση του γενωμικού DNA από το ολικό αίμα ασθενών με κίρρωση και υγιών μαρτύρων. Ακολούθησε η γονοτύπηση των δειγμάτων μέσω της τεχνολογίας TaqMan SNP Genotyping Assays για τον προσδιορισμό των ApaI, BsmI, TaqI και FokI πολυμορφισμών. Πραγματοποιήθηκε απομόνωση των μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMCs) από ολικό αίμα υγιών και ασθενών με την μέθοδο φυγοκέντρησης βαθμίδωσης φικόλης και φαινοτύπιση των PBMCs για τον προσδιορισμό των κυτταρικών υποπληθυσμών CD3+VDR+ και CD14+VDR+, με κυτταρομετρία ροής. Με την ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA έγινε η ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης του VDR στο πλάσμα υγιών και ασθενών. Πραγματοποιήθηκε ποσοτικοποίηση του mRNA των γονιδίων που ρυθμίζονται από το σηματοδοτικό μονοπάτι D-VDR, μέσω real time PCR. Τέλος, εφαρμόστηκαν προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής για τη μελέτη των διαφορετικών δομών της πρωτεΐνης VDR και της αλληλεπίδρασης D-VDR, παρουσία και απουσία (wt) του FokI πολυμορφισμού. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν σημαντική αρνητική συσχέτιση των επιπέδων του CD14+VDR+ κυτταρικού υποπληθυσμού με τον δείκτη κλινικής σοβαρότητας της νόσου MELD score. Η παρουσία του ApaI πολυμορφισμού συσχετίστηκε με σημαντική μείωση των επιπέδων των CD3+VDR+ κυττάρων στους κιρρωτικούς ασθενείς. Η παρουσία του FokI πολυμορφισμού συσχετίστηκε με σημαντική αύξηση των επιπέδων των CD3+VDR+ κυττάρων τόσο στους υγιείς όσο και στους κιρρωτικούς ασθενείς. Η παρουσία των BsmI και TaqI VDR πολυμορφισμών συσχετίστηκε με σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης VDR στο πλάσμα. Η παρουσία των ApaI και BsmI VDR πολυμορφισμών συσχετίστηκε με σημαντική αύξηση της έκφρασης του γονιδίου Gpx στους κιρρωτικούς ασθενείς. Η παρουσία των BsmI και TaqI VDR πολυμορφισμών συσχετίστηκε με σημαντική μείωση του PMCA γονιδίου. Η παρουσία του BsmI πολυμορφισμού συσχετίστηκε με σημαντική μείωση του JMJD1A γονιδίου και των επιπέδων ηπατικής ακαμψίας στους κιρρωτικούς ασθενείς. Μέσω των προσομοιώσεων ΜΔ, παρατηρήθηκε ότι ο FokI πολυμορφισμός εκφράζει ένα πρωτεϊνικό προϊόν, το οποίο στην περιοχή διασύνδεσης της επικράτειας δέσμευσης της βιταμίνης D και της επικράτειας δέσμευσης στο DNA έχει 5 αμινοξέα λιγότερα σε σχέση με τη φυσιολογική ισομορφή. Στην παρούσα μελέτη η κλινική βαρύτητα της κίρρωσης συσχετίστηκε με τα επίπεδα VDR και η παρουσία των VDR πολυμορφισμών στους κιρρωτικούς ασθενείς συσχετίστηκε σημαντικά με τα επίπεδα της πρωτεΐνης VDR. Επομένως θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι οι πολυμορφισμοί στο γονίδιο του VDR πιθανόν να σχετίζονται με την εξέλιξη της κίρρωσης επηρεάζοντας τα επίπεδα πρωτεΐνης VDR. Η συσχέτιση των VDR πολυμορφισμών με την έκφραση γονιδίων, τα οποία ρυθμίζονται από τη δραστηριότητα D-VDR και εμπλέκονται σε σημαντικές βιολογικές διεργασίες για τη φυσιολογική λειτουργία του ηπατοκυττάρου και την ομοιόσταση των ανοσολογικών αποκρίσεων αποτελεί άλλο ένα πιθανό σημείο συμβολής των VDR πολυμορφισμών στην εξέλιξη της κίρρωσης. Τέλος, η επίδραση του FokI πολυμορφισμού στην περιοχή διασύνδεσης των δύο επικρατειών που συνεργάζονται για την πρόσδεση του VDR στο DNA, αναδεικνύει την πιθανότητα επίδρασης του πολυμορφισμού στη λειτουργικότητα της επικράτειας δέσμευσης στο DNA, με πιθανό αντίκτυπο στη δραστηριότητα μεταγραφής του υποδοχέα VDR.