Gastropod biodiversity in freshwater ecosystems of the Aegean Archipelago: patterns, processes & threats

Abstract

The present doctoral thesis is the first comprehensive study of freshwater gastropods in the under-studied aquatic systems of the Aegean Sea. Freshwater gastropods are characterized as habitat specialists with low dispersal abilities that have successfully colonized all types of freshwater bodies. The Aegean archipelago with a complex geological and palaeogeographical history represents an ideal system for biodiversity and evolutionary studies. The insular aquatic systems of the Aegean archipelago are characterized by small area size and, nearly half of them, ephemeral presence of water due to semi-arid conditions. These features result in them being the most vulnerable ecosystems in the Aegean Archipelago. The aims of the doctoral thesis are to investigate the patterns of biodiversity and ecology of freshwater gastropods throughout the study area, as well as to reconstruct the phylogenetic relationships of selected gastropod taxa. In Chapter 1, freshwater gastropod fauna from the aquatic systems of 11 Aegean islands was documented. Overall, 40 native and 4 invasive freshwater gastropod species belonging to 9 and 4 families, respectively, were identified by employing morphological, anatomical, and molecular data analyses. Our field work showed that most taxa mostly occur in karst springs and small headwater streams/brooks fed by the springs rather than other aquatic systems. We also identified diversity hotspots within this group, characterized by a high number of native and endemic species. Canonical Correspondence Analysis (CCA) was performed to examine if there is correlation between species presence and environmental variables. CCA succeeded in explaining 81% of the variance of the data. Lastly, we investigated the presence of any hierarchical community structure in our data using network analyses looking for patterns according to the delineated freshwater ecoregions of Greece and the paleogeography of the Aegean. Our analyses did not reveal any strong modular structure when either of the two algorithms was implemented. However, when Louvain method was applied in all native species, eastern Aegean islands were grouped together and were separated from the remaining ones. This pattern is an indication of the defining impact of the Mid-Aegean (MAT) creation on the existing biotic affinities. In Chapter 2, the two gastropod genera, namely Bythinella and Pseudamnicola that stood out for their large number of species present in Greece and the high levels of endemism, were selected, to reconstruct their phylogenetic relationships using mtDNA molecular markers and investigate the evolutionary processes responsible for shaping their current distribution on the island of Crete. For Bythinella, our findings strongly support the presence of at least five species in Crete, out of which four correspond to already described species and one was recovered for the first time in the present study. The analyses revealed a relatively old timeframe of diversification, dating back to the middle Miocene (ca.14 Mya), with allopatric speciation events being the main drivers of the evolution of the genus within the island. For Pseudamnicola, there is strong evidence for the presence of at least two species in Crete and a relatively recent time of diversification that started in the late Miocene. Dispersion processes followed by isolation of the populations and/or recent speciation, seem to be the underlying process for the current distribution of Pseudamnicola lineages. In Chapter 3, the phylogenetic pattern of the genus Pseudamnicola throughout its Mediterranean range was also investigated using molecular data available and newly produced. This is the first time that molecular data from Greek taxa are incorporated in a phylogenetic analysis for Pseudamnicola of this spatial scale. Our findings are in favor of Pseudamnicola having diversified quite recently during the late Miocene. The ancestral distributional area recovered was the Italian Peninsula & Islands together with the Ionian Drainages. The main speciation events of the genus are estimated to have taken place during the Pleistocene. Two different dispersal routes are suggested for the gradual spread of Pseudamnicola within the Mediterranean. One of the routes involved a westward dispersion towards the Iberian Peninsula and then to NW Africa. The second dispersal route involves a westward dispersion towards Italy and Spain and an eastward one towards the Aegean Archipelago and the Eastern Mediterranean. During this study, it became obvious that the molecular markers commonly used in phylogeographic or phylogenetic studies of freshwater gastropods, are rarely successive in fully resolving the phylogenetic relationships of the taxa under question. This was also the case in part of the phylogenetic analyses performed in this study. Within the frame of this study, sequence data originating from three different mtDNA genes (cytochrome c oxidase subunit I: COI, 16S rDNA and cytochrome b) were systematically checked for their ability to unambiguously resolve the phylogenetic relationships of the taxa investigated. Among the three mtDNA genes, COI was always the one that provided the highest level of phylogenetic resolution, whereas 16S rDNA and cytochrome b were systematically failing to provide additional phylogenetic information for resolving the relationships of the taxa involved. In some cases, the phylogenetic analyses relying on COI sequence data, were also suffering from low resolution levels. Therefore, it has become obvious that in order to resolve the phylogenetic relationships of freshwater gastropods, a new set of molecular markers must be identified. In Chapter 4, hence, within the frame of this study, we aimed to evaluate the effectiveness of the Ultra-Conserved Elements (UCEs) in resolving freshwater gastropods relationships. UCEs are highly conserved regions of genomic DNA that can function as regulators and/or enhancers of gene expression and have been discovered across a variety of both vertebrate and invertebrate taxa. Therefore, after the generation of four (4) low depth gastropod genomes and the inclusion of six (6) already available gastropod genomes, a caenogastropod dataset of 24 taxa was constructed that qualified for the identification (via specialized bioinformatic analyses) of UCEs that were shared among gastropods. Following the identification of the UCEs, a set of baits targeting the conserved regions shared by gastropods was designed. Finally, the utility of these baits for collecting UCE sequence data across gastropod lineages, with a particular emphasis on enriching UCE loci from freshwater caenogastropod taxa, was evaluated. Based on the results of the bioinformatic analyses, a set of 12092 probes were identified, and these were commercially synthesized as an RNA target capture array detecting 1234 loci, in total, out of which 1224 UCE loci were shared across the alignments of the 24 caenogastropd species participating in the study. Using the sequence data generated through high throughput sequence, a phylogenetic analysis involving the 24 gastropod taxa was performed. The resulting phylogeny demonstrated the utility of the gastropod-specific UCE loci in resolving the relationships among and within gastropod clades and supported the monophyly of the three major gastropod clades represented by multiple taxa: Caenogastropoda, Neritimorpha and Heterobranchia. Furthermore, our analysis strongly supports Neritimorpha as a sister group to Caenogastropoda and recovers Heterobranchia as a sister group to Caenogastropoda and Neritimorpha. In previous studies, UCE loci have been found to be very useful for recovering both deep-level phylogenetic relationships and shallow-level genus and population relationships. Therefore, within the frame of this study, in Chapter 5, the variability and utility of UCEs in reconstructing species-level relationships within the genus Bythinella was also investigated. European and Greek taxa were employed to investigate the performance of UCEs in resolving phylogenetic relationships and compare their efficiency against commonly used mtDNA markers, such as COI. The phylogenetic tree resulting from the UCEs sequence data was fully resolved and outperformed the tree generated using COI data alone, laying the groundwork for the efficient use of UCEs for inferring phylogenies and delineating species at lower taxonomic levels.

Τα γαστερόποδα είναι μια από τις παλαιότερες και πιο επιτυχημένες ομάδες ζώων που διαβιούν στη γη και αποτελούν περίπου το 80% των ζωντανών μαλακίων. Έχουν εποικήσει σχεδόν όλα τα θαλάσσια, εσωτερικά ύδατα και χερσαία οικοσυστήματα σε όλες της ηπείρους πλην της Ανταρκτικής και εμφανίζουν υψηλή ποικιλομορφία σε όλα τα ταξινομικά επίπεδα που υπερβαίνεται μόνο από τα έντομα. Υπάρχουν έξι κύριες ομάδες αναγνωρισμένες επί του παρόντος (Patellogastropoda, Neomphalina, Vetigastropoda, Neritimorpha, Heterobranchia και Caenogastropoda) και περισσότερες από 500 υπάρχουσες οικογένειες γαστερόποδων. Τα γαστερόποδα εσωτερικών υδάτων ή αλλιώς «υδρόβια γαστερόποδα» αντιστοιχούν στο περίπου ~10% της πανίδας των γαστερόποδων με 9.976 επί του παρόντος ονομαζόμενα είδη. Εκπρόσωποι των εσωτερικών υδάτων απαντώνται μόνο στα Neritimorpha, Caenogastropoda και Heterobranchia με τις δύο τελευταίες ομάδες να περιέχουν την πλειονότητα των 33-38 εκτιμώμενων οικογενειών που εμφανίζονται σε ενδιαιτήματα εσωτερικών υδάτων. Με ελάχιστες εξαιρέσεις, τα περισσότερα υδρόβια γαστερόποδα έχουν κέλυφος. Ορισμένες ομάδες χρησιμοποιούν ένα σύνολο βραγχίων ή ένα μόνο βράγχιο για να αναπνεύσουν, ενώ άλλες χρησιμοποιούν έναν λεπτό, αγγειοποιημένο «πνεύμονα» για την ανταλλαγή αερίων. Εμφανίζουν μεγάλη οικολογική εξειδίκευση, περιορισμένη γεωγραφική κατανομή, αργούς ρυθμούς αναπαραγωγής και σχετικά μεγάλη διάρκεια ζωής, γεγονός που τα καθιστά πιο ευάλωτα στις προκλήσεις που προκαλούνται από τον άνθρωπο. Κατά συνέπεια, δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι το 20% των επιβεβαιωμένων εξαφανίσεων μαλακίων αποδίδεται σε υδρόβια γαστερόποδα.Το αρχιπέλαγος του Αιγαίου εκτείνεται σε 615 km2 στη λεκάνη της Μεσογείου και βρίσκεται μεταξύ της Βαλκανικής Χερσονήσου και της Μικράς Ασίας. Με περίπου 7.800 νησιά και βραχονησίδες, είναι ένα από τα μεγαλύτερα αρχιπελάγη στον κόσμο που βρίσκεται πάνω από τη σύνδεση τριών βιογεωγραφικών ζωνών, δηλαδή της Ευρώπης, της Ασίας και της Αφρικής. Τα υψηλά επίπεδα κλιματικής και τοπογραφικής ποικιλότητας, η περίπλοκη παλαιογεωγραφική ιστορία, τα υψηλά επίπεδα βιοποικιλότητας και ενδημισμού το καθιστούν ιδανικό σύστημα μοντέλου για τη νησιωτική βιογεωγραφία. Ο τεκτονισμός, η έντονη ηφαιστειακή δραστηριότητα και ο ευστατισμός είναι οι τρεις κύριες διαδικασίες που είχαν ως αποτέλεσμα την ύπαρξη πολλών κύκλων σύνδεσης και απομόνωσης κοντινών νησιωτικών και ηπειρωτικών περιοχών σε όλη την ιστορία των νησιών του Αιγαίου. Τα νησιά του Αιγαίου χαρακτηρίζονται από μεσογειακού τύπου κλίμα που είναι αρκετά ποικιλόμορφο. Οι συχνές ξηρασίες, χαρακτηριστικές των μεσογειακών οικοσυστημάτων, έχουν αντίκτυπο στα μεσογειακά υδατικά συστήματα. Οι τύποι εσωτερικών υδάτων στα νησιά του Αιγαίου ποικίλλουν από πηγές και μικρούς υγροτόπους μέχρι κολπίσκους, ρυάκια και λίγα ποτάμια. Ωστόσο, τα μη πολυετή ρέματα με καθεστώτα διαλείπουσας έως επεισοδιακής ροής κυριαρχούν σε ημίξηρες περιοχές όπως τα νησιά του Αιγαίου. Εκτός από τις παρατεταμένες ξηρασίες, οι ανθρωπογενείς δραστηριότητες που σχετίζονται με άντληση νερού δημιουργεί πρόσθετες πιέσεις στα υδατικά συστήματα που επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό την υδρόβια χλωρίδα και πανίδα. Πολλά από τα είδη που ζουν σε αυτά τα συστήματα απειλούνται με εξαφάνιση καθώς η υποβάθμιση των οικοσυστημάτων τους προχωρά με υψηλό ρυθμό λόγω των ανθρώπινων παρεμβάσεων και της κλιματικής αλλαγής.Τα υδρόβια γαστερόποδα θεωρούνται μια από τις πιο απειλούμενες ομάδες μαλακίων λόγω της χαμηλής επιβίωσής τους και των υψηλών ρυθμών εξαφάνισης που προκύπτουν από την απώλεια και την υποβάθμιση των ενδιαιτημάτων τους και την εισαγωγή εισβολικών ειδών. Αποτελούν μια θεμελιώδη ομάδα της υδρόβιας πανίδας μακρο-ασπόνδυλων, η οποία εμφανίζει υψηλά επίπεδα ενδημισμού στα ελληνικά νησιά. Ωστόσο, η εικόνα της πανίδας των νησιωτικών υδάτινων σωμάτων είναι αποσπασματική, καθώς καμία ομάδα ασπόνδυλων που διαβιούν σε αυτά, δεν έχει μελετηθεί συστηματικά. Επιπλέον, το πιο πρόσφατο Κόκκινο Βιβλίο των Απειλούμενων Ζώων της Ελλάδας (2009) δεν περιλαμβάνει κανένα είδος υδρόβιων γαστερόποδων, γεγονός που είναι ενδεικτικό της σοβαρής έλλειψης δεδομένων για αυτήν την ομάδα. Οι περισσότερες μελέτες για τα υδρόβια γαστερόποδα έχουν επικεντρωθεί μέχρι σήμερα σε μεμονωμένες περιγραφές ειδών και ανακατασκευή φυλογενετικών σχέσεων εντός γενών ή ειδών και πολύ λίγες αφορούν τα πρότυπα βιοποικιλότητας αυτής της ομάδας. Η συστηματική ταξινόμηση των υδρόβιων γαστερόποδων χρησιμοποιώντας μορφολογικά και ανατομικά χαρακτηριστικά του σώματος και του κελύφους τους έχει αποδειχθεί δύσκολη υπόθεση λόγω των ελλιπών ειδοδιακριτών χαρακτηριστικών και της παρουσίας πολλών κρυπτικών ειδών. Ως εκ τούτου, έχουν χρησιμοποιηθεί μοριακά δεδομένα για την επίλυση προβλημάτων ταξινομικής φύσης και την ασφαλή αναγνώριση ειδών. Η παρούσα διδακτορική διατριβή είναι η πρώτη ολοκληρωμένη μελέτη υδρόβιων γαστερόποδων στα υπό-μελετημένα υδατικά συστήματα του Αιγαίου Πελάγους. Σκοπός της είναι η εξέταση των προτύπων βιοποικιλότητας των υδρόβιων γαστερόποδων, η ανακατασκευή των φυλογενετικών σχέσεων επιλεγμένων ταξινομικών ομάδων γαστερόποδων και η διερεύνηση μιας νέας ομάδας φυλογενομικών δεικτών ως προς την αποτελεσματικότητα τους στην επίλυση φυλογενετικών σχέσεων στην Ομοταξία των Γαστερόποδων. Στο 1ο Κεφάλαιο, καταγράφηκε η πανίδα των γαστερόποδων εσωτερικών υδάτων στα υδάτινα συστήματα 11 νησιών του Αιγαίου. Συνολικά, συλλέχθηκαν και αναγνωρίστηκαν 40 αυτόχθονα είδη υδρόβιων γαστερόποδων που ανήκουν σε 9 οικογένειες και 4 εισβολικά είδη που ανήκουν σε 3 οικογένειες χρησιμοποιώντας μορφολογικά, ανατομικά και μοριακά δεδομένα. Οι δειγματοληψίες πεδίου μας έδειξαν ότι τα περισσότερα είδη εμφανίζονται σε καρστικές πηγές και μικρά ρέματα / ρυάκια που τροφοδοτούνται από τις πηγές παρά σε άλλα υδάτινα συστήματα. Τα δύο μεγαλύτερα νησιά, Κρήτη και Εύβοια, εμφάνισαν το μεγαλύτερο πλούτο ειδών και ποσοστό ενδημισμού, ενώ η Τήνος και η Λήμνος αποτέλεσαν τα πιο φτωχά νησιά σε υδρόβια γαστερόποδα. Επίσης, διερευνήθηκαν και εντοπίστηκαν στατιστικά σημαντικά θερμά σημεία (hotspots) βιοποικιλότητας, που χαρακτηρίζονται από υψηλό αριθμό αυτόχθονων και ενδημικών ειδών με τη χρήση του εργαλείου HotSpot Analysis Tool (Getis-Ord Gi*) του λογισμικού QGIS (3.16.0 - Hannover). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ανάλυση κανονικής αντιστοιχίας (CCA) προκειμένου να εξεταστεί εάν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας ειδών και των περιβαλλοντικών μεταβλητών. Ανάμεσα στις μεταβλητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν φυσικοχημικές παράμετροι που μετρήθηκαν στα πλαίσια των δειγματοληψιών, το υψόμετρο και οι 19 βιοκλιματικές μεταβλητές για κάθε σταθμό δειγματοληψίας. Η CCA κατάφερε να εξηγήσει το 81% της διακύμανσης των δεδομένων. Για τα περισσότερα γένη, η θέση τους στο γράφημα μπορούσε να εξηγηθεί από τις οικολογικές τους απαιτήσεις και τη βιολογία τους. Πολυάριθμες έρευνες που αφορούν την οριοθέτηση βιογεωγραφικών περιοχών στο Αιγαίο χρησιμοποιώντας δεδομένα παρουσίας φυτών ή ζώων έχουν διεξαχθεί τα τελευταία χρόνια, αποκαλύπτοντας αξιοσημείωτα πρότυπα ποικιλότητας ειδών που συχνά συνδέονται με την παλαιογεωγραφία του Αιγαίου. Παρόλα αυτά η χρήση ομάδων οργανισμών γλυκού νερού σε τέτοιες μελέτες είναι μέχρι στιγμής ανύπαρκτη, επομένως στην παρούσα μελέτη κατασκευάστηκαν οικολογικά δίκτυα χρησιμοποιώντας δεδομένα παρουσίας/απουσίας ειδών υδρόβιων γαστερόποδων στα νησιά της περιοχής μελέτης. Δύο διαφορετικοί αλγόριθμοι (αλγόριθμοι NETCARTO και Louvain) δοκιμάστηκαν και εκτιμήθηκε η τιμή του δείκτη δομοστοιχείωσης (Modularity Index) των δεδομένων. Οι αλγόριθμοι NETCARTO και Louvain ανίχνευσαν την παρουσία μιας και δύο ομάδων (κοινοτήτων), αντίστοιχα, με απουσία όμως ισχυρής δομοστοιχειωτής οργάνωσης. Συγκεκριμένα, η μέθοδος Louvain ανίχνευσε δύο διακριτές ομάδες, που η μια περιλαμβάνει όλα τα νησιά του ανατολικού Αιγαίου και η δεύτερη όλα τα υπόλοιπα νησιά. Αυτό το μοτίβο πιθανόν να αποτελεί ένδειξη του καθοριστικού αντίκτυπου της δημιουργίας της Μέσο-Αιγαιακής Τάφρου (ΜΑΤ), που εκτιμάται ότι συνέβη πριν από ~ 12 εκ. χρόνια, στα πρότυπα εξάπλωσης των ειδών, όπως αυτά παρατηρούνται σήμερα. Στο Κεφάλαιο 2, επιλέχθηκαν δύο γένη υδρόβιων γαστερόποδων, το γένος Bythinella και το γένος Pseudamnicola, που ξεχώρισαν για το μεγάλο αριθμό ειδών και τα υψηλά ποσοστά ενδημισμού στην Ελλάδα για να πραγματοποιηθεί ανακατασκευή των φυλογενετικών τους σχέσεων και διερεύνηση των εξελικτικών διαδικασιών που ευθύνονται για την σημερινή κατανομή τους με τη χρήση ευρύτατα χρησιμοποιούμενων μοριακών δεικτών. Συγκεκριμένα, διεξήχθη μια φυλογεωγραφική μελέτη των δύο γενών χρησιμοποιώντας αλληλουχίες από μιτοχονδριακά γονίδια εντός του νησιού της Κρήτης, το οποίο είναι γνωστό για την περίπλοκη παλαιογεωγραφική του ιστορία. Για την Bythinella, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν σθεναρά την ύπαρξη τουλάχιστον πέντε ειδών που εξαπλώνονται στην Κρήτη, τα οποία αντιστοιχούν στα ήδη περιγεγραμμένα είδη από προηγούμενες μελέτες με την προσθήκη ενός νέου και αποκαλύπτουν ένα παλιότερο χρονικό πλαίσιο διαφοροποίησης, με φαινόμενα αλλοπάτριας ειδογένεσης να είναι πιθανότατα οι κύριοι παράγοντες που διαμορφώνουν τη σημερινή κατανομή των ειδών στο νησί. Για το γένος της Pseudamnicola, τα δεδομένα μας δείχνουν την παρουσία τουλάχιστον δύο ειδών στην Κρήτη με σχετικά πρόσφατη διαφοροποίηση που ακολουθεί ένα μοτίβο απομόνωσης από απόσταση που οδήγησε σε ειδογένεση. Στο Κεφάλαιο 3, ανακατασκευάστηκε το πρότυπο της φυλογένεσης του γένους της Pseudamnicola σε όλη τη μεσογειακή περιοχή εξάπλωσής του με τη χρήση μοριακών δεδομένων από τα ελληνικά είδη για πρώτη φορά. Η παρούσα μελέτη καταδεικνύει ξεκάθαρα τη διάκριση μεταξύ των γενών Pseudamnicola και Corrosella και απορρίπτει την παλαιότερη αντιστοίχιση του Erosiconcha geliayana καθώς και την τρέχουσα αντιστοίχιση του Pseudamnicola emilianus στο γένος Pseudamnicola. Όσον αφορά το γένος της Pseudamnicola, αυτό προκύπτει ότι διαφοροποιήθηκε αρκετά πρόσφατα κατά το τέλος του Μειόκαινου (6.53 Mya) ξεκινώντας από την Ιταλική Χερσόνησο και την περιοχή του Ιονίου πελάγους και τα κύρια γεγονότα ειδογένεσης άρχισαν να συμβαίνουν κατά τη διάρκεια του Πλειστόκαινου. Δύο διαφορετικές διαδρομές εξάπλωσης του γένους υποδεικνύονται από την περιοχή προγονικής προέλευσης, μία διαδρομή δυτικά προς την Ιβηρική Χερσόνησο και τη ΒΔ Αφρική και μια δεύτερη προς τα δυτικά και τα ανατολικά προς την Ιταλία και την Ισπανία και προς το Αιγαίο Πέλαγος και την Ανατολική Μεσόγειο. Γενικά, η εκτεταμένη εξάπλωση και ο υψηλός πλούτος ειδών του Pseudamnicola σε όλη τη λεκάνη της Μεσογείου μπορεί να εξηγηθεί από την ικανότητα του γένους να εποικίζει διάφορα υδάτινα ενδιαιτήματα. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι πρόσφατα φαινόμενα διασποράς που ακολουθήθηκαν από φαινόμενα γεωγραφικής απομόνωσης ήταν ο κύριος μηχανισμός διαφοροποίησης του γένους. Για τις φυλογενετικές αναλύσεις στα παραπάνω κεφάλαια δοκιμάστηκαν διάφοροι κοινοί μοριακοί δείκτες. Εκτός από την υπομονάδα 1 του μιτοχονδριακού γονιδίου της κυτοχρωμικής οξειδάσης (COI), δοκιμάστηκαν τα επίσης μιτοχονδριακά γονίδια 16S rRNA και κυτόχρωμα β, με τα δύο τελευταία να αδυνατούν να προσφέρουν επιπλέον γενετική πληροφορία στις αναλύσεις μας. Ωστόσο, το γονίδιο COI έδειξε επίσης αδυναμία στην πλήρη επίλυση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των διαφόρων ταξινομικών ομάδων γαστερόποδων, επομένως μια νέα προσέγγιση κρίθηκε κατάλληλη να δοκιμαστεί και να εφαρμοστεί που περιλαμβάνει τη χρήση των λεγόμενων Ultra-Conserved Elements (UCES). Τα UCEs είναι εξαιρετικά διατηρημένα τμήματα του γονιδιώματος τα οποία μπορούν να λειτουργήσουν ως ρυθμιστές ή/και ενισχυτές της γονιδιακής έκφρασης και έχουν βρεθεί σε διάφορες ομάδες οργανισμών από ανθρώπους μέχρι κοράλλια και έντομα. Με αφορμή τη δυσκολία επίλυσης των φυλογενετικών σχέσεων στα υδρόβια γαστερόποδα με τους παραδοσιακούς μοριακούς δείκτες, στο Κεφάλαιο 4, η έρευνα προσανατολίστηκε στη νέα αυτή ομάδα φυλογενομικών δεικτών, τα UCEs. Για πρώτη φορά, εξετάστηκε και επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη των υπερ–συντηρημένων αυτών στοιχείων σε γονιδιώματα υδρόβιων γαστερόποδων που ήταν κατατεθειμένα σε βάσεις δεδομένων και σε επιπλέον τέσσερα (4) γονιδιώματα που παράχθηκαν εργαστηριακά. Αφού εντοπίστηκαν τα UCEs με μεθόδους βιοπληροφορικής στα γονιδιώματα αυτά, στη συνέχεια σχεδιάστηκαν 12.092 ειδικοί RNA εκκινητές – δολώματα που στοχεύουν σε αυτές τις κοινές διατηρημένες περιοχές και δοκιμάστηκε η χρησιμότητα αυτών των δολωμάτων για τη συλλογή δεδομένων UCEs μεταξύ διαφόρων ειδών γαστερόποδων, με ιδιαίτερη έμφαση σε είδη που ανήκουν στην ομάδα των Caenogastropoda. Η ομάδα των Caenogastropoda περιλαμβάνει το 60% όλων των ζωντανών γαστερόποδων και έχει επιδείξει σημαντική προσαρμοστική διαφοροποίηση η οποία αντικατοπτρίζεται στην εξαιρετική ποικιλομορφία που παρατηρείται σε αυτή. Κατασκευάστηκαν γονιδιωματικές βιβλιοθήκες και έγινε εμπλουτισμός των UCEs χρησιμοποιώντας τους ειδικούς εκκινητές που σχεδιάστηκαν. Συνολικά, εντοπίστηκαν 1.234 UCEs γενετικοί τόποι, εκ των οποίων οι 1224 τόποι μοιράζονταν μεταξύ 24 ειδών υδρόβιων γαστερόποδων που ανήκουν σε 21 διαφορετικές οικογένειες. Η μελέτη μας κατέδειξε τη χρησιμότητα και αποτελεσματικότητα των ειδικών για γαστερόποδα UCE τόπων στην επίλυση των σχέσεων μεταξύ και εντός των κύριων κλάδων των γαστερόποδων που μέχρι τώρα παρέμεναν ανεπίλυτοι με τη χρήση παραδοσιακών μοριακών δεικτών. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσαν ότι οι τρεις κύριες ομάδες γαστερόποδων (Caenogastropoda, Neritimorpha και Heterobranchia) είναι μονοφυλετικές ομάδες με πολύ καλή στήριξη και επιπλέον, υποστηρίζουν σθεναρά την ομάδα των Neritimorpha ως αδελφή ομάδα της ομάδας των Caenogastropoda και ανακτούν την ομάδα των Heterobranchia ως αδελφή ομάδα των ομάδων Caenogastropoda και Neritimorpha. Στο Κεφάλαιο 5, εξετάστηκε η χρησιμότητα των UCEs στην επίλυση πρόσφατων φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ ειδών εκτός από την ήδη διαγνωσμένη δυνατότητα τους για επίλυση βαθύτερων σχέσεων ανώτερων ταξινομικών ομάδων. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε η επίλυση των φυλογενετικών σχέσεων εντός του γένους της Bythinella, το οποίο είναι ένα γαστερόποδο που κατανέμεται από τη δυτική Ευρώπη (Ιβηρική Χερσόνησος) έως το δυτικό τμήμα της Ασίας και τυπικά, απαντάται σε υψηλές αφθονίες σε πηγές γλυκού νερού, αλλά και σε μικρά ρυάκια και υπόγεια ύδατα. Το γένος αυτό έχει απουσία διακριτής διαφοροποίησης οικολογικών θώκων, καθώς και μορφολογικών και ανατομικών χαρακτηριστικών, γεγονός το οποίο αποδίδεται στη μη προσαρμοστική διαφοροποίηση που μάλλον έχει υποστεί το γένος. Ως αποτέλεσμα, η οριοθέτηση ειδών στο γένος της Bythinella με βάση μόνο τα χαρακτηριστικά είτε του κελύφους είτε των μαλακών μερών του σώματος έχει αποδειχθεί ένα αμφιλεγόμενο έργο που απαιτεί την προσθήκη μοριακών δεδομένων. Στην έρευνα αυτή, χρησιμοποιήθηκαν άτομα από ευρωπαϊκά και ελληνικά είδη, έγινε ανακατασκευή των φυλογενετικών τους σχέσεων με τη χρήση των UCEs αλλά και με τον κλασικό μιτοχονδριακό δείκτη, το γονίδιο COI και στη συνέχεια, συγκρίθηκε η αποτελεσματικότητα τους. Το φυλογενετικό δέντρο που προέκυψε από τα UCEs ήταν πλήρως επιλυμένο με πολύ καλή στήριξη σε όλα τα κλαδιά πλην ενός που είχε μέτρια στήριξη, επιτυγχάνοντας να διακρίνει τα ελληνικά είδη από τα υπόλοιπα ευρωπαϊκά. Το δέντρο αυτό υπερτερεί ολοκληρωτικά έναντι του δέντρου που προέκυψε από τη χρήση δεδομένων COI, το οποίο είχε μόνο σε δύο κλαδιά καλή στήριξη (> 80%) θέτοντας έτσι τις βάσεις για την αποτελεσματική χρήση των UCEs για φυλογενετικές αναλύσεις και οριοθέτηση ειδών σε χαμηλότερο ταξινομικό επίπεδο, από την μέχρι τώρα συνήθη χρήση τους.