The immune defense mechanisms of macrophages against pathogens in early life

Abstract

Neonatal sepsis is a major cause of morbidity and mortality among term and preterm infants in both developed and developing countries worldwide. Several studies have identified E. coli and Streptococcus agalactiae (GBS) as the leading causative agents of sepsis in this vulnerable age group. Though these pathogens are commensals for healthy adults, in neonates such infections have particularly devastating outcomes for both infant hosts and their families. Despite antibiotic treatment there are no other available therapies for the management of neonatal sepsis. A major contributor of neonatal susceptibility to infections is the immature state of neonatal adaptive and innate immune responses. During this tender period of life, adaptive immunity is still underdeveloped, whereas innate immune responses are untrained and partly disarmed compared to those of adults. Since the molecular and cellular mechanisms of neonatal innate immune defense against pathogens and sepsis have not been clearly elucidated, their understanding is crucial to develop new targeted and effective therapies for this detrimental condition. DEL-1 is a molecule with profound immunomodulatory and anti-inflammatory properties with fundamental role in inflammatory disease pathology. By utilizing wild type (WT) healthy and septic mice of adult and neonatal age, we observed that DEL-1 expression was systemically elevated in healthy neonates compared to adults and further increased under septic conditions as opposed to septic adults. To investigate the role of DEL-1 in the context of neonatal sepsis, we utilized WT and DEL-1-/- that we subjected to polymicrobial sepsis. We found that DEL-1 -/- mice displayed profound neutropenia, exaggerated bacteremia and overall diminished survival in response to sepsis, defects that were rescued by the exogenous administration of DEL-1. The basis of these defects relies on the diminished numbers of myeloid-biased hematopoietic stem cells, granulocyte progenitors and neutrophils in the bone marrow of septic DEL-1 -/- mice, indicating the importance of DEL-1 as an integral component of the neonatal bone marrow niche that exerts its protective effects via supporting emergency granulopoiesis. We also demonstrate that the sustained tissue production of DEL-1 in newborn sepsis was attributed to the high IL-10/IL-17A ratio that neonates display. Specifically, we provide evidence that as IL-10 upregulates DEL-1, as blockade of IL-10 signaling diminished both the expression and the beneficial effects of DEL-1. Consistent with the mouse findings, DEL-1 and neutrophil numbers were higher in septic human adult and neonate patients with high IL-10/IL-17A ratio. Furthermore, septic patients with high DEL-1 exhibited lower mortality rates compared to patients with low DEL-1. In conclusion, we highlight the role of a hitherto unappreciated IL-10–DEL-1 axis in the maintenance of the bone marrow neutrophil pool, which is inadequate in infancy, by supporting emergency granulopoiesis, thus preventing neutropenia and promoting sepsis survival in early life. Next, we studied the role of adult and neonatal macrophages in response to GBS infection. GBS is a commensal for healthy adults but a leading cause of sepsis and meningitis among neonates and young infants. To study the molecular mechanisms of macrophage immunity against GBS we utilized thioglycolate elicited peritoneal macrophages from adult and neonate mice that we stimulated with GBS. Unlike adult macrophages, GBS infection in neonatal macrophages was characterized by elevated intracellular bacterial load, enhanced cytoplasmic escape and decreased targeting to lysosomes for degradation. Using confocal microscopy analysis and a series of siRNA molecules we demonstrated that LC3 Associated Phagocytosis (LAP) is the driver immune mechanism mediating GBS clearance in adult macrophages. However, neonatal macrophages suffer from profound deficits in LAP pathway as indicated by the diminished co-localization of GBS with LC3. GBS infected neonatal macrophages acquired a unique metabolic and inflammatory profile, baring both pro- and anti-inflammatory characteristics. RNA-seq analysis revealed that neonatal macrophages produce exacerbated amounts of IL-6 in response to infections that negatively impact LAP. In fact, the administration of IL-6 in murine adult macrophages impeded their antibacterial activity. In contrast, the universal inhibition of IL-6 or the selective inhibition of its trans signaling mode improved the bactericidal capacity of the GBS infected macrophages in a LAP dependent manner. Similarly, the inhibition of the downstream signaling mediators JAK1/2 and STAT-3 significantly decreased intracellular load and cytoplasmic escape of GBS, while enhancing LC3 deposition on internalized bacteria. In accordance with our findings on the murine model, the inhibition of IL-6R with Tocilizumab, augments the capacity of human cord blood macrophages to eliminate GBS. Finally, we demonstrate that the IL-6 targeting therapies can have potential in vivo and prolong the survival of GBS infected murine pups. Hence, the administration of immunomodulatory therapies targeting the IL-6/JAK1&2/STAT-3 axis may confer protection from invasive GBS infection in newborns by effectively activating the intracellular defense mechanisms of macrophages against invading pathogens. The findings of the current study can potentially lead to the development of targeted therapies that may improve neonatal sepsis prognosis and morbidity that remain too dismal.

Η νεογνική σήψη είναι μια από τις βασικές αιτίες θνητότητας και θνησιμότητας βρεφών παγκοσμίως, τόσο στις αναπτυσσόμενες όσο και στις ανεπτυγμένες χώρες. Πλήθος μελετών έχουν αναδείξει τα παθογόνα E. coli και Streptococcus agalactiae (GBS) ως τους κύριους λοιμώδεις παράγοντες που προκαλούν σήψη σε αυτή την ευαίσθητη ηλικιακή ομάδα. Παρά το γεγονός ότι και τα δύο αυτά παθογόνα είναι αβλαβή για τους υγιείς ενήλικες οργανισμούς, οι λοιμώξεις αυτών των παθογόνων στα νεογνά έχουν σοβαρές επιπτώσεις τόσο για τους ίδιους τους ξενιστές όσο και για τις οικογένειές τους. Μέχρι στιγμής, η μόνη διαθέσιμη θεραπεία για τη διαχείριση της νεογνικής σήψης είναι η χορήγηση αντιβιοτικών. Ένας βασικός παράγοντας που καθιστά τα νεογνά επιρρεπή στην ανάπτυξη λοιμώξεων είναι η ανωριμότητα του νεογνικού ανοσοποιητικού συστήματος, τόσο της έμφυτης όσο και της επίκτητης ανοσίας. Σε αυτή τη τρυφερή περίοδο της ζωής, η γραμμή της επίκτητης ανοσίας δεν έχει αναπτυχθεί επαρκώς, ενώ οι έμφυτες ανοσολογικές αποκρίσεις παραμένουν μερικώς εκπαιδευμένες και ανεπαρκείς, σε σχέση με αυτές των ενήλικων οργανισμών. Καθώς οι μοριακοί και κυτταρικοί μηχανισμοί άμυνας της νεογνικής έμφυτης ανοσίας δεν είναι επαρκώς χαρακτηρισμένοι, η σε βάθος κατανόηση τους είναι απαραίτητη για το σχεδιασμό νέων στοχευμένων και αποτελεσματικών θεραπευτικών προσεγγίσεων έναντι της νεογνικής σήψης. Η πρωτεΐνη DEL-1 είναι ένα μόριο με χαρακτηριστικές ανοσοτροποποιητικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες, που διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη παθολογία φλεγμονωδών νόσων. Χρησιμοποιώντας αγρίου τύπου (WT) υγιή και σηπτικά, νεογνά και ενήλικα ποντίκια παρατηρήσαμε ότι έκφραση αυτού του παράγοντα είναι συστημικά αυξημένη στα νεογνά σε σχέση με τα ενήλικα ποντίκια, ενώ παρουσία σήψης αυξήθηκαν ακόμη περισσότερο σε αντίθεση με τα επίπεδα των σηπτικών ενήλικων ποντικών. Προκειμένου να διερευνήσουμε το ρόλο της πρωτεΐνης DEL-1 στο πλαίσιο της νεογνικής σήψης, χρησιμοποιήσαμε νεογνά WT και DEL-1 -/- γονοτύπου τα οποία υποβάλαμε σε πολυμικροβιακή σήψη. Παρατηρήσαμε ότι τα DEL-1 -/- νεογνά ποντίκια παρουσίασαν έντονη ουδετεροπενία, οξυμένη βακτηριαιμία και σημαντικά μειωμένη επιβίωση στη σήψη, συμπτώματα τα οποία αναστράφηκαν έπειτα από τη χορήγηση εξωγενούς DEL-1. Η βάση αυτών των συμπτωμάτων βρίσκεται στο μειωμένο αριθμό των μυελικών αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων και των πρόγονων ουδετερόφιλων στο μυελό των οστών των σηπτικών DEL-1 -/- νεογνών, αναδεικνύοντας τη σημασία της πρωτεΐνης DEL-1 ως αναπόσπαστο συστατικό του νεογνικού μυελού που διαμεσολαβεί τις προστατευτικές του ιδιότητες, στηρίζοντας την επείγουσα μυελοποίηση. Επιπλέον αναδεικνύουμε ότι η αυξημένη ιστική παραγωγή της DEL-1 στα σηπτικά νεογνά αποδίδεται στην αυξημένη αναλογία IL-10/IL-17A κυτταροκινών. Συγκεκριμένα, δείχνουμε ότι η κυτταροκίνη IL-10 ρυθμίζει θετικά την DEL-1, καθώς η παρεμπόδιση του σηματοδοτικού μονοπατιού της IL-10 μείωσε τόσο την έκφραση όσο και τις ευεργετικές δράσεις της DEL-1. Σε συμφωνία με τα δεδομένα μας από τα πειραματικά μας μοντέλα, τόσο η DEL-1 όσο και ο αριθμός των κυκλοφορόντων ουδετερόφιλων είναι αυξημένα στους σηπτικούς ασθενείς που χαρακτηρίζονται από υψηλή αναλογία IL-10/IL-17A. Επιπλέον, οι σηπτικοί ασθενείς με υψηλότερα επίπεδα DEL-1 παρουσιάζουν καλύτερη επιβίωση σε σχέση με τους ασθενείς με χαμηλά επίπεδα DEL-1. Συμπερασματικά, σε αυτή τη μελέτη αναδεικνύουμε του σηματοδοτικού άξονα IL-10–DEL-1 στη διατήρηση των αποθεμάτων ουδετερόφιλων στο μυελό των οστών, τα οποία είναι ανεπαρκή κατά τη νεογνική ηλικία, στηρίζοντας την επείγουσα μυελοποίηση και την επιβίωση των σηπτικών νεογνών. Έπειτα μελετήσαμε το ρόλο των ενήλικων και των νεογνικών μακροφάγων στην λοίμωξη με το Στρεπτόκοκκο Βήτα Ομάδας (GBS). Ο GBS είναι ένα ευκαιριακό παθογόνο για τους υγιείς ενήλικες οργανισμούς, όμως για τα νεογνά και να νεαρά βρέφη αποτελεί μία από τις κύριες αιτίες σήψης και μηνιγγίτιδας παγκοσμίως. Για να διερευνήσουμε τους μοριακούς μηχανισμούς άμυνας των μακροφάγων έναντι του GBS χρησιμοποιήσαμε περιτοναϊκά μακροφάγα από νεογνά και ενήλικα ποντίκια τα οποία στη συνέχεια μολύναμε με GBS. Σε αντίθεση με τα μακροφάγα των ενηλίκων, η λοίμωξη του GBS στα νεογνικά μακροφάγα οδήγησε σε αύξηση του ενδοκυττάριου βακτηριακού φορτίου, μεγαλύτερη κυτταροπλασματική διαφυγή των βακτηρίων και μειωμένη στόχευσή τους στα λυσοσώματα για καταστροφή. Με τη χρήση συνεστιακής μικροσκοπίας και μίας σειράς μορίων siRNA, αποδείξαμε ότι ο μηχανισμός της LC3 εξαρτώμενης φαγοκυττάρωσης (LAP) είναι ο βασικός διαμεσολαβητής της βακτηριοκτόνου δράσης των ενήλικων μακροφάγων κυττάρων έναντι του GBS. Ωστόσο, στα νεογνικά μακροφάγα ο μηχανισμός αυτός είναι μη λειτουργικός όπως καταδεικνύεται από τον μειωμένο συν εντοπισμό του GBS με την LC3. Κατά τη μόλυνσή τους με GBS τα νεογνικά μακροφάγα αποκτούν ένα διακριτό μεταβολικό και φλεγμονώδες προφίλ, το οποίο παρουσιάζει προφλεγμονώδη και αντιφλεγμονώδη χαρακτηριστικά. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της RNA-seq ανάλυσης, έπειτα από τη διέγερσή τους με τον GBS τα νεογνικά μακροφάγα παρουσιάζουν υπέρμετρη παραγωγή της κυτταροκίνης IL-6, η οποία έχει ανασταλτική δράση στο μονοπάτι της LAP. Πράγματι, η χορήγηση εξωγενούς IL-6 σε ενήλικα μακροφάγα κύτταρα, παρεμποδίζει τη βακτηριοκτόνο δράση τους. Αντιθέτως η στόχευση της IL-6 ή πιο συγκεκριμένα του trans σηματοδοτικού της μονοπατιού, ενισχύει την αντιβακτηριακή δραστηριότητα των νεογνικών μακροφάγων έναντι του GBS μέσω του μηχανισμού της LAP. Ομοίως, η παρεμπόδιση των κάτωθεν σηματοδοτικών μορίων της IL-6, JAK1/2 και STAT-3, μείωσε σημαντικά το ενδοκυττάριο βακτηριακό φορτίο και τη κυτταροπλασματική διαφυγή του GBS στα νεογνικά μακροφάγα, ενισχύοντας παράλληλα τον συν-εντοπισμό των ενδοκυττάριων βακτηρίων με την πρωτεΐνη LC3. Σε συμφωνία με τα μέχρι τώρα δεδομένα μας από το πειραματικό μοντέλο των ποντικών, η χημική αναστολή του IL-6R με τον παράγοντα Tocilizumab στα μακροφάγα ομφάλιου λώρου, βελτιώνει την ικανότητα τους να καταπολεμήσουν τον GBS. Τέλος, σε αυτή τη μελέτη παραθέτουμε στοιχεία ότι η στόχευση του σηματοδοτικού άξονα της IL-6 έχει τη δυνατότητα να παρατείνει την επιβίωση των μολυσμένων με GBS νεογνών ποντικών. Για το λόγο αυτό, η χορήγηση ανοσοτροποποιητικών θεραπειών που θα στοχεύσουν συγκεκριμένα τον άξονα IL-6/JAK1&2/STAT-3 θα μπορούσε να προστατεύσει τα νεογνά ενάντια λοιμώξεων από τον GBS, ενισχύοντας τους ενδοκυττάριους μηχανισμούς άμυνας των μακροφάγων έναντι των οπορτουνιστικών παθογόνων. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης θα μπορούσαν μελλοντικά να οδηγήσουν στην ανάπτυξη στοχευμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων που θα συνεισφέρουν στη πρόγνωση και θεραπεία της νεογνικής σήψης που παραμένει πενιχρή.