Ανάπτυξη και εφαρμογές αναλυτικών μεθόδων για τον προσδιορισμό ξενοβιοτικών ενώσεων σε ζωικούς και φυτικούς οργανισμούς θαλάσσιων οικοσυστημάτων: εκτίμηση επικινδυνότητας

Abstract

One of the major issues of recent years is the control of the residuality of organic pollutants in various environmental substrates, which necessitates the development of reliable analytical methods for their detection. In recent years, the number of studies dealing with the development and application of analytical methods to estimate the concentration levels and fate of such xenobiotic compounds in the environment is constantly increasing. Most of these studies deal mainly with surface water and soil, but there is a lack of data on aquatic ecosystems, as well as on the organisms that live in them. In this Thesis, analytical methods were developed and validated for the determination of 14 selected polychlorinated biphenyls (PCBs) and 4 nitrofuran metabolites in fish and seafood samples. The methods were finally applied in areas of Greece and Portugal, where, apart from other man-made activities, aquaculture also operates. Criteria for the selection of the compounds were their constant presence in the environment, including compounds whose use has been banned but are still detected. A Gas Chromatography system coupled with Mass Spectrometry (GC-MS) was used for the determination of PCBs with a total analysis time of 30 minutes. A liquid chromatography system coupled with high resolution mass spectrometry was used for the determination of nitrofuran metabolites, with a total analysis time of ten minutes. Matrix match calibration curves and in the case of nitrofuran metabolites also an internal standard was used for the quantification on the selected compounds. For the determination of PCBs in fish and seafood samples, QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) extraction method was chosen. To determine the optimal extraction conditions, the extraction solvent, the extraction salts, the amount of the sample and different combinations of adsorbents were studied for the clean-up step. After optimization, validation of the analytical methodology followed for each substrate. In mussel samples the recoveries ranged from 72.5% to 109.5%, while the standard deviation was less than 10%. In fish samples, recoveries ranged from 72.1% to 85.0%, while repeatability and intra-laboratory reproducibility were less than 10%. Regarding the limits of quantification, they were less than 2.5 ng g-1 for all PCBs on both substrates. Furthermore, values of matrix effect were found to vary for mussel samples between -28.9% and 22.0% indicating a moderate to slight effect and for fish samples between -17.8% and 16.0% indicating a slight effect. The last stage for the validation of the analytical methodology was the estimation of the uncertainty of the method, where it was found for all PCBs at values below 53% on both substrates. Subsequently, the validation was extended for the remaining organisms under study at the low fortification level, with the analytical characteristics of the method making it suitable for these substrates as well. Finally, the coefficient of linearity was above 0.99 in all cases. After the validation of the method, application to real fish and seafood samples from one region in Greece and one in Portugal followed. In the samples collected from the Greek region, none of the selected PCBs were found above the detection limit. On the contrary, in the area of Tagus River, PCBs were detected and quantified in crab, seaweed and mussel samples. Two sampling campaigns conducted in the same year, one after a rainy season and one after a dry season, and in the second season, the positive detections of PCBs were more in number and in higher concentrations. For the determination of nitrofuran metabolites in fish tissue samples, liquid-liquid extraction was chosen after digestion of the sample, which is also the main method used for these analytes. Recoveries ranged from 85.2% to 98.4%, while repeatability and intra-laboratory reproducibility were less than 10%. Regarding the limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) they were calculated at 0.1 ng g-1 and 0.25 ng g-1 respectively. The last stage for the validation of the analytical methodology was the estimation of the uncertainty of the method, where it was found at values below 50% for all metabolites. The validated methodology was applied to fish samples from a Mediterranean aquaculture over a period of four years. Among the four metabolites, the metabolite Amoz was detected in a large number of samples but only in the first year of the sampling. The concentrations ranged from the quantification level of the method, up to 3.96 ng g-1, with the Reference Point for Action (RPA) being 1.0 ng g-1. All actions required by the legislation were taken by the fish farm, with the result that in the following months Amoz concentrations gradually decreased and finally came to values below the detection limit of the method. Finally, a chronic dietary risk assessment was performed for both selected groups of compounds. Regarding the risk from polychlorinated biphenyls, Hazard Index (HI) did not exceed 0.25, confirming that the risk from seafood consumption remains low for each individual food. For nitrofuran metabolites, there is no specific acceptable consumption limit, as the legislation is strict and taking all the necessary actions, the risk to the consumer remains minimal.

Ένα από τα μείζονα θέματα των τελευταίων ετών αποτελεί ο έλεγχος της υπολειμματικότητας οργανικών ρύπων σε περιβαλλοντικά υποστρώματα, γεγονός που καθιστά αναγκαία την ανάπτυξη αξιόπιστων αναλυτικών μεθόδων για τον προσδιορισμό τους. Αν και αυξάνεται ο αριθμός των ερευνών για την εκτίμηση των συγκεντρώσεων οργανικών ρύπων στο περιβάλλον, η πλειοψηφία τους ασχολείται κυρίως με επιφανειακά ύδατα και έδαφος, ενώ είναι λιγοστές αυτές που ασχολούνται με τα υδάτινα οικοσυστήματα, καθώς και τους οργανισμούς που ζούνε σε αυτά. Στην παρούσα Διατριβή αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν αναλυτικές μέθοδοι για τον προσδιορισμό 14 επιλεγμένων πολυχλωριωμένων διφαινυλίων (PCBs) και 4 μεταβολιτών νιτροφουρανίων σε δείγματα ιχθυρών και θαλασσινών. Οι μέθοδοι τελικά εφαρμόστηκαν σε περιοχές της Ελλάδας και της Πορτογαλίας, που είναι δέκτες διαφορετικών ρύπων ανθρωπογενούς προέλευσης. Κριτήρια για την επιλογή των ενώσεων ήταν η παρουσία τους στο περιβάλλον, καθώς συμπεριλήφθηκαν ενώσεις των οποίων η χρήση έχει απαγορευτεί αλλά ακόμα ανιχνεύονται.Για τον προσδιορισμό των PCBs χρησιμοποιήθηκε σύστημα αέριας χρωματογραφίας συζευγμένο με φασματομετρία μάζας (GC-MS) με συνολικό χρόνο ανάλυσης τα 30 λεπτά. Για τον προσδιορισμό των μεταβολιτών νιτροφουρανίων χρησιμοποιήθηκε σύστημα υγρής χρωματογραφίας συζευγμένης με φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας, με συνολικό χρόνο ανάλυσης δέκα λεπτά. Για την ποσοτικοποίηση χρησιμοποιήθηκαν καμπύλες προσομοίωσης υποστρώματος και στην περίπτωση των μεταβολιτών νιτροφουρανίων και εσωτερικό πρότυπο. Για τον προσδιορισμό των PCBs στα δείγματα υδρόβιων οργανισμών επιλέχθηκε η μέθοδος εκχύλισης QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe). Οι συνθήκες που βελτιστοποιήθηκαν ήταν ο διαλύτης εκχύλισης, τα άλατα εκχύλισης, η ποσότητα δείγματος και οι διαφορετικοί συνδυασμοί προσροφητικών στο στάδιο καθαρισμού. Μετά τη βελτιστοποίηση ακολούθησε και επικύρωση της αναλυτικής μεθοδολογίας για κάθε υπόστρωμα. Στα δείγματα μυδιού οι ανακτήσεις κυμάνθηκαν από 72.5% έως 109.5%, ενώ η τυπική απόκλιση ήταν μικρότερη του 10%. Στα δείγματα ψαριού οι ανακτήσεις κυμάνθηκαν από 72.1% έως 85.0%, ενώ η η επαναληψιμότητα και η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα ήταν μικρότερες του 10%. Όσον αφορά τα όρια ποσοτικοποίησης, ήταν μικρότερα από 2.5 ng g-1 για όλα τα PCBs και στα δύο υποστρώματα. Επιπλέον, οι τιμές της (%) επίδρασης του υποστρώματος βρέθηκαν να κυμαίνονται για τα δείγματα μυδιών μεταξύ -28.9% και 22.0% υποδηλώνοντας μέτρια με ελαφριά επίδραση και για τα δείγματα ψαριών μεταξύ -17.8% και 16.0% υποδηλώνοντας ελαφριά επίδραση. Τελευταίο στάδιο για την επικύρωση της αναλυτικής μεθοδολογίας, ήταν και η εκτίμηση της αβεβαιότητας της μεθόδου, όπου βρέθηκε για όλα τα PCBs σε τιμές κάτω του 53% και στα δύο υποστρώματα. Στη συνέχεια, έγινε και επέκταση της επικύρωσης και για τους υπόλοιπους υπό μελέτη οργανισμούς στο χαμηλό επίπεδο εμβολιασμού, με τα αναλυτικά χαρακτηριστικά της μεθόδου να την κάνουν κατάλληλη και για αυτά τα υποστρώματα. Τέλος, ο συντελεστής γραμμικότητας ήταν πάνω από 0.99 σε όλες τις περιπτώσεις.Μετά την επικύρωση της μεθόδου ακολούθησε και εφαρμογή της σε πραγματικά δείγματα υδρόβιων οργανισμών από μία περιοχή στην Ελλάδα και μία στην Πορτογαλία. Στα δείγματα που συλλέχθηκαν από την ελληνική περιοχή δεν βρέθηκε κανένα από τα επιλεγμένα PCBs πάνω από το όριο ανίχνευσης. Αντιθέτως, στην περιοχή από τις εκβολές του Τάγου ποταμού ανιχνεύθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν PCBs στα δείγματα κάβουρα, φυκιών και μυδιών. Έγιναν δύο δειγματοληψίες μέσα στην ίδια χρονιά, μία μετά από περίοδο βροχοπτώσεων και μία μετά από περίοδο ξηρασίας και στη δεύτερη περίοδο, οι θετικές ανιχνεύσεις PCBs ήταν περισσότερες στον αριθμό αλλά και σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις. Για τον προσδιορισμό των μεταβολιτών νιτροφουρανίων στα δείγματα ιχθυρών επιλέχθηκε η υγρή – υγρή εκχύλιση μετά από όξινη υδρόλυση του δείγματος που είναι και η κύρια μέθοδος που χρησιμοποιείται για αυτούς τους αναλύτες. Στα δείγματα ψαριού οι ανακτήσεις κυμάνθηκαν από 85.2% έως 98.4%, ενώ η η επαναληψιμότητα και η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα ήταν μικρότερες του 10%. Όσον αφορά τα όρια ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικοποίησης (LOQ) υπολογίστηκαν στο 0.1 ng g-1 και 0.25 ng g-1 αντίστοιχα. Τελευταίο στάδιο επικύρωσης της αναλυτικής μεθοδολογίας, ήταν και η εκτίμηση της αβεβαιότητας της μεθόδου, όπου βρέθηκε σε τιμές κάτω του 50% για όλους τους μεταβολίτες. Η επικυρωμένη μεθοδολογία εφαρμόστηκε σε δείγματα ιχθύων από υδατοκαλλιέργεια της Μεσογείου για διάστημα τεσσάρων ετών. Από του τέσσερις μεταβολίτες ανιχνεύθηκε ο μεταβολίτης Amoz, σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων αλλά μόνο στο πρώτο εξάμηνο των δειγματοληψιών. Οι συγκεντρώσεις του κυμάνθηκαν από το όριο ποσοτικοποίησης της μεθόδου, μέχρι και 3.96 ng g-1, με το όριο δράσης να είναι 1.0 ng g-1. Όλα τα απαραίτητα από τη νομοθεσία μέτρα λήφθηκαν από την ιχθυοκαλλιέργεια, με αποτέλεσμα στους επόμενους μήνες οι συγκεντρώσεις του Amoz να μειώνονται σταδιακά και τελικώς να έρθουν σε τιμές κάτω από το όριο ανίχνευσης της μεθόδου. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε εκτίμηση της χρόνιας διατροφικής επικινδυνότητας και για τις δύο επιλεγμένες ομάδες ενώσεων. Αναφορικά με την επικινδυνότητα από πολυχλωριωμένα διφαινύλια, ο δείκτης κινδύνου (Hazard Index) δεν ξεπέρασε το 0.25, επιβεβαιώνοντας πως ο κίνδυνος από την κατανάλωση θαλασσινών παραμένει χαμηλός για κάθε τρόφιμο ξεχωριστά. Για τους μεταβολίτες νιτροφουρανίων, δεν υπάρχει συγκεκριμένο αποδεκτό όριο κατανάλωσης, καθώς η νομοθεσία είναι αυστηρή και λαμβάνοντας όλα τα απαραίτητα μέτρα, ο κίνδυνος για τον καταναλωτή παραμένει μηδαμινός.