Ενθυλάκωση βιοδραστικών ενώσεων σε φυσικά πολυμερή με εφαρμογή καινοτόμων μεθόδων νανοεγκλεισμού

Abstract

The aim of this PhD thesis was to study the innovative electrohydrodynamic process for the encapsulation of bioactive compounds. The compounds of interest were deoxycholic acid, a secondary bile acid, and the extract derived from hydroponic tomato cultivation by-products, while the encapsulation products were also exploited by incorporating them into a cosmetic product and a film for food packaging, respectively. In the case of the extract, leaves and stems from hydroponic tomato cultivation were freeze-dried and extracted using various extraction methods to receive and evaluate their bioactive content. The leaves had the richest content in bioactive components, while the combination of stirring for 72 hours with the subsequent use of ultrasounds to receive the remaining entrapped bioactive compounds stood out among the extraction methods studied. This leaf extract was further studied using High-Pressure Liquid Chromatography for the identification of flavonoids (mainly rutin), carotenoids (mainly lutein and β-carotene)) and the alkaloids tomatine-tomatidine, indicating its antioxidant and antimicrobial activity. A detailed study of the electro-hydrodynamic process and its two aspects, electrospraying and electrospinning, followed. Initially, solutions of various polymers (hydroxy-propyl-β-cyclodextrin, polylactic acid, chitosan and zein) were applied to the equipment, studying different combinations of operating conditions and polymer concentrations regarding their ability to form a product and its morphology. Among these polymers, zein gave the most interesting results by leading to the formation of both discrete particles and uniform fibers when changing its concentration and for several combinations of operating conditions. Experiments, to select the optimal ethanol-water solvent ratio and protein concentration to obtain both configurations (particles and fibers) followed. Of the ethanol/water mixtures, the 90/10 (v/v) ratio was found to be the most ideal for electrospraying and the 80/20 (v/v) ratio for electrospinning based on the solutions’ properties (surface tension, electrical conductivity and viscosity). Subsequently, the effect of the operating parameters of the process on the diameter of the structures was examined. As observed, increasing flow rate and concentration led to structures with larger diameters while, conversely, increasing distance and applied voltage led to a decrease in diameter. From the combined study of these parameters, the concentrations of 10 and 25% (w/v) were selected to obtain the optimal particles and fibers, respectively, from zein. In the next step, the encapsulation of the bioactive ingredients was performed and the process was optimized to achieve the maximum encapsulation efficiency (EE%) using the central composite design. For comparison purposes, the active agents were also encapsulated by applying the conventional spray drying method with the same encapsulation matrix. For this process, optimization was also performed to achieve the maximum possible EE%. The highest EE% was measured for the electrospraying product, followed by the electrospun fibers, the spray dried particles of the encapsulated deoxycholic acid and finally of the extract. In total, EE% ranged between 79 and 93% for all the samples. The encapsulation products were, then, evaluated in terms of their structure-morphology with the nanofibers of the encapsulated extract showing the smallest diameter (0.32 ± 0.083 μm) followed by the nanoparticles of deoxycholic acid (0.37 ± 0.09 μm) while spray drying gave structures between 7.5-8.5 μm. In addition, through differential scanning calorimetry, the stability of the glass transition temperature of the nanoparticles and nanofibers was observed, which ranged from 129-145 ℃ regardless of the samples’ previous placement in different humidity control chambers (aw=0.11-0.95) and temperature (25 and 45 ℃). In contrast, the spray-dried structures appeared more susceptible to moisture absorption. Commonly used models describing water sorption isotherms (GAB, BET, Oswin, Halsey) were applied to these samples and it was shown that the GAB model had the best fit to the data for both samples stored at 25 and 45 ℃. The study of the structures using Fourier transform infrared spectroscopy showed that the characteristic peaks of the matrix remained unchanged by the encapsulation process while characteristic peaks of the components were identified for all the products, confirming their successful encapsulation. Subsequently, the release of the components in a solvent environment and also during storage in chambers of different relative humidity was studied. Regarding the release in a solvent environment, this was observed to be significantly faster for the encapsulated products through spray drying. Between the two products of the electro-hydrodynamic process, the nanoparticles showed a slightly faster release of the substance than the nanofibers. Regarding the release from the chamber of different water activities, this proved to be slower for all samples compared to the release from the solvent environment. In addition, the release rate was greater for the encapsulated bioactives through spray drying followed by those from electrospraying and finally electrospinning, showing the same behavior with the release in the solvent environment. In addition, entrapment of the bioactives inside the matrix and inability to release due to structure collapse for the samples placed in chambers of RH 75-95% was observed for the spray drying products. Subsequently, the encapsulation products derived from the electro-hydrodynamic process were utilized for the production of consumer products. More specifically, the electrosprayed nanoparticles of deoxycholic acid were incorporated into an oil-in-water emulsion to prepare a cosmetic cream. The formulation was studied for its appearance, color, pH, microbiological stability and rheological characteristics during storage at 5, 25, 37 and 45 ℃ for three months compared to the same cream without the incorporation of the encapsulated bioactive. The results showed that the addition of the ingredient did not alter the characteristics of the cream, its microbiological stability was maintained and small color changes were observed while the pH ranged between 4.45-5 for all the samples. Regarding its rheological characteristics, the complex viscosity showed a slight change compared to that of the simple base cream, while satisfactory values were also measured over time in the different storage conditions (|η*|≥ 1.24 MPa·s for ω=0, 1 1/s at t=90d at 45℃). As for the storage (G') and loss (G'') modulus, the relationship G'> G'' was maintained for the entire range of angular frequencies measured, indicating the existence of a stable formulation. As for the encapsulated tomato leaf extract in electrospun zein nanofibers, it was used as a thin coating for biaxially oriented polypropylene to form a bilayer packaging film. The two layers were stabilized together through chemical and mild heat treatments. The final film was evaluated for the morphology of the fibers which appeared flattened due to the treatment they underwent, without however resulting to a collapse of their structure and with the observation of only a small loss of encapsulated extract (≈4.6%). The produced film was used for tomato packaging in comparison with plain polypropylene film. Samples were stored at 5℃, room temperature and 45 ℃ and were, daily, measured for their color, weight loss, pH, total bacterial count-yeasts/molds and their sensory properties. The results showed that the fruits packed with the bilayer film developed microbial load more slowly, leading to an extension of shelf life by 1-3 days. Finally, a life cycle assessment (LCA) study was presented for the cosmetic formulation and the packaging film with the encapsulated bioactive ingredients in terms of the environmental footprint of the processes required compared to the production of conventional materials. Regarding the cosmetic cream, LCA focused on the production of the cream and the encapsulation with the study showing the increase in the environmental footprint with the addition of the encapsulated bioactive ingredient. Accordingly, regarding the production cost, it was estimated to be higher by €0.045/cosmetic formulation for the cream with the bioactive ingredient compared to the base cream (estimated at €0.20/cosmetic formulation). However, this study did not include efficacy data from the use of the substance that would offset this increase. Regarding the packaging film, the environmental footprint of the active material was compared with that of the conventional film for all stages, from the harvest of the leaves to the result of their use. Functional film demonstrated better environmental performance at all stages of the supply chain apart from the production stage compared to plain film, which was offset by the benefits of utilization of agricultural by-products to create value-added materials and extend the shelf life of the packaged products. In terms of economic evaluation, the production cost of the bilayer film was estimated to increase by €0.36/kg film.

Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της καινοτόμου ηλεκτρο-υδροδυναμικής διεργασίας για την ενθυλάκωση βιοδραστικών συστατικών. Τα συστατικά ενδιαφέροντος ήταν το δεοξυχολικό οξύ, ένα δευτερογενές χολικό οξύ και το εκχύλισμα από τα παραπροϊόντα υδροπονικής καλλιέργειας τομάτας ενώ τα προϊόντα ενθυλάκωσής τους αξιοποιήθηκαν και με την ενσωμάτωσή τους σε καλλυντικό προϊόν και φιλμ για συσκευασία τροφίμων, αντίστοιχα. Στην περίπτωση του εκχυλίσματος, φύλλα και βλαστοί από την υδροπονική καλλιέργεια τομάτας αποξηράθηκαν και εκχυλίστηκαν με διάφορες μεθόδους εκχύλισης και στόχο την παραλαβή και αξιολόγηση του βιοδραστικού περιεχομένους τους. Το πλουσιότερο περιεχόμενο σε βιοδραστικά συστατικά, είχαν τα φύλλα ενώ ο συνδυασμός της ανάδευσης για 72 ώρες με την επακόλουθη χρήση υπερήχων για την παραλαβή των εναπομεινάντων εγκλωβισμένων βιοδραστικών να ξεχωρίζει μεταξύ των μεθόδων εκχύλισης που μελετήθηκαν. Το εκχύλισμα αυτό των φύλλων, μελετήθηκε περαιτέρω με χρήση Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης για την ταυτοποίηση φλαβονοειδών (κυρίως ρουτίνη), καροτεινοειδών (κυρίως λουτεΐνη και β-καροτένιο)) και των αλκαλοειδών τοματίνη, τοματιδίνη, υποδεικνύοντας την αντιοξειδωτική και αντιμικροβιακή δράση του. Ακολούθησε λεπτομερής μελέτη της ηλεκτρο-υδροδυναμικής διεργασίας και ως προς τις δύο εκφάνσεις της, τον ηλεκτροστατικό ψεκασμό και την ηλεκτροστατική ινοποίηση. Αρχικά, εφαρμόστηκαν στη διάταξη διαλύματα διαφόρων πολυμερών (υδροξυ-προπυλο-β-κυκλοδεξτρίνη, πολυγαλακτικό οξύ, χιτοζάνη και ζεΐνη), μελετώντας διαφορετικούς συνδυασμούς λειτουργικών συνθηκών και συγκεντρώσεών τους και αξιολογήθηκε τόσο η ικανότητά τους να σχηματίσουν προϊόν αλλά και η μορφολογία του προϊόντος αυτού. Μεταξύ των πολυμερών αυτών, η ζεΐνη έδωσε τα πιο ενδιαφέροντα αποτελέσματα για την παρούσα μελέτη καθώς διαπιστώθηκε η ικανότητα σχηματισμού διακριτών σωματιδίων αλλά και ομοιόμορφων ινών με μεταβολή της συγκέντρωσής της και για αρκετούς συνδυασμούς συνθηκών. Ακολούθησαν πειράματα για την επιλογή της βέλτιστης αναλογίας διαλυτών αιθανόλης-νερού και συγκέντρωσης της πρωτεΐνης για την παραλαβή και των δύο διαμορφώσεων (σωματιδίων και ινών). Από τα μίγματα αιθανόλης/νερού, η αναλογία 90/10 (v/v) κρίθηκε η ιδανικότερη για τον ηλεκτροστατικό ψεκασμό και η αναλογία 80/20 (v/v) για την ινοποίηση με βάση χαρακτηριστικά των παραγόμενων διαλυμάτων (επιφανειακή τάση, ηλεκτρική αγωγιμότητα και ιξώδες). Στη συνέχεια με τους επιλεγμένους διαλύτες, εξετάστηκε η επίδραση των λειτουργικών παραμέτρων της διεργασίας στην διάμετρο των δομών. Όπως παρατηρήθηκε, η αύξηση της ροής και της συγκέντρωσης οδηγεί σε δομές μεγαλύτερων διαμέτρων ενώ αντίθετα αύξηση της απόστασης και της εφαρμοζόμενης τάσης οδηγούν σε μείωση της διαμέτρου. Από τη συνδυαστική μελέτη των παραμέτρων αυτών επιλέχθηκαν οι συγκεντρώσεις 10 και 25% (w/v) για παραλαβή των βέλτιστων σωματιδίων και ινών, αντίστοιχα για τη ζεΐνη. Σε επόμενο βήμα, πραγματοποιήθηκε η ενθυλάκωση των βιοδραστικών συστατικών και έγινε αριστοποίηση της διεργασίας για την επίτευξη της μέγιστης απόδοσης εγκλεισμού με χρήση του σχεδιασμού κεντρικού σημείου. Για λόγους σύγκρισης, τα βιοδραστικά συστατικά ενθυλακώθηκαν και με εφαρμογή της κλασικής μεθόδου της ξήρανσης με ψεκασμό με την ίδια μήτρα ενθυλάκωσης. Για τη διεργασία αυτή, πραγματοποιήθηκε επίσης βελτιστοποίηση για την επίτευξη της μέγιστης δυνατής απόδοσης εγκλεισμού. Τις υψηλότερες τιμές απόδοσης εγκλεισμού έδωσε ο ηλεκτροστατικός ψεκασμός, ακολουθούμενος από την ηλεκτροστατική ινοποίηση, την ξήρανση με ψεκασμό για το δεοξυχολικό οξύ και τέλος για το εκχύλισμα. Συνολικά οι αποδόσεις εγκλεισμού κυμάνθηκαν μεταξύ 79 έως 93% για το σύνολο των δειγμάτων. Τα προϊόντα των διεργασιών εγκλεισμού αξιολογήθηκαν, στη συνέχεια, ως προς τη δομή-μορφολογία τους με τις νανοΐνες του ενθυλακωμένου εκχυλίσματος να εμφανίζουν την μικρότερη διάμετρο (0,32 ± 0,083 μm) ακολουθούμενες από τα νανοσωματίδια του δεοξυχολικού οξέος (0,37 ± 0,09 μm) ενώ η ξήρανση με ψεκασμό έδωσε δομές μεταξύ 7,5-8,5 μm. Επιπλέον, μέσω της διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης παρατηρήθηκε η σταθερότητα του σημείου υαλώδους μετάπτωσης των νανοσωματιδίων και νανοϊνων που κυμάνθηκε στους 129-145 ℃ ανεξάρτητα από την παραμονή των δειγμάτων σε διαφορετικές συνθήκες υγρασίας (aw=0,11-0,95) και θερμοκρασίας (25 και 45 ℃). Αντίθετα οι δομές της ξήρανσης με ψεκασμό φάνηκαν πιο επιρρεπείς στην προσρόφηση υγρασίας. Για τα δείγματα αυτά εφαρμόστηκαν ευρέως χρησιμοποιούμενα μοντέλα που περιγράφουν τις ισόθερμες ρόφησης (GAB, BET, Oswin, Halsey) και αποδείχθηκε ότι η GAB είχε την καλύτερη προσαρμογή στα δεδομένα τόσο για τα δείγματα που αποθηκεύτηκαν στους 25 όσο και στους 45 ℃. Η μελέτη των δομών με χρήση της φασματομετρίας με μετασχηματισμό Fourier έδειξε ότι οι χαρακτηριστικές κορυφές της μήτρας παρέμειναν αμετάβλητες από τη διεργασία ενθυλάκωσης ενώ για το σύνολο των προϊόντων εντοπίστηκαν χαρακτηριστικές κορυφές των συστατικών, επιβεβαιώνοντας τον επιτυχή εγκλεισμό τους. Ακολούθως, μελετήθηκε η απελευθέρωση των συστατικών σε περιβάλλον διαλύτη αλλά και κατά την αποθήκευση σε θαλάμους διαφορετικής σχετικής υγρασίας. Όσον αφορά στην απελευθέρωση σε περιβάλλον διαλύτη, αυτή παρατηρήθηκε σημαντικά ταχύτερη για τα προϊόντα ενθυλάκωσης μέσω της ξήρανσης με ψεκασμό. Μεταξύ, δε, των δύο προϊόντων της ηλεκτρο-υδροδυναμικής διεργασίας, τα νανοσωματίδια επέδειξαν ελαφρώς ταχύτερη απελευθέρωση της ουσίας σε σχέση με τις νανοΐνες. Όσον αφορά στην απελευθέρωση από του θαλάμους διαφορετικών ενεργοτήτων νερού, αυτή αποδείχθηκε για όλα τα δείγματα βραδύτερη σε σχέση με την απελευθέρωση από περιβάλλον διαλύτη. Επιπλέον ο ρυθμός απελευθέρωσης ήταν μεγαλύτερος για τα εγκλεισμένα βιοδραστικά μέσω της ξήρανσης με ψεκασμό ακολουθούμενος από αυτόν των νανοσωματιδίων και τέλος των νανοϊνών, δηλαδή συμπεριφορά ανάλογη της απελευθέρωσης και στο περιβάλλον διαλύτη. Επιπλέον παρατηρήθηκε εγκλωβισμός των βιοδραστικών στο εσωτερικό της μήτρας και αδυναμία απελευθέρωσης λόγω κατάρρευσης της δομής σε περιβάλλον σχετικής υγρασίας 75-95% για τα προϊόντα της ξήρανσης με ψεκασμό. Στη συνέχεια, τα προϊόντα ενθυλάκωσης μέσω της ηλεκτρο-υδροδυναμικής διεργασίας αξιοποιήθηκαν για την παραγωγή καταναλωτικών προϊόντων. Πιο συγκεκριμένα, ενθυλακωμένο δεοξυχολικό οξύ από τον ηλεκτροστατικό ψεκασμό ενσωματώθηκε σε γαλάκτωμα τύπου O/W για την παρασκευή καλλυντικής κρέμας. Το σκεύασμα μελετήθηκε ως προς την εμφάνιση, το χρώμα, το pH, την μικροβιολογική του σταθερότητα και τα ρεολογικά του χαρακτηριστικά κατά την αποθήκευσή του στους 5, 25, 37 και 45 ℃ για τρεις μήνες συγκριτικά με την ίδια κρέμα χωρίς την ενσωμάτωση του εγκλεισμένου βιοδραστικού. Όπως φάνηκε, η προσθήκη του συστατικού δεν αλλοίωσε τα χαρακτηριστικά της κρέμας, διατηρήθηκε η μικροβιολογική της σταθερότητας, παρατηρήθηκαν μικρές μεταβολές στο χρώμα ενώ το pΗ κυμάνθηκε μεταξύ του 4,45-5 για όλα τα δείγματα. Όσο αφορά στα ρεολογικά του χαρακτηριστικά, το σύνθετο ιξώδες μεταβλήθηκε ελάχιστα σε σχέση με αυτό της απλής κρέμας βάσης ενώ μετρήθηκαν και ικανοποιητικές τιμές του σε βάθος χρόνου στις διαφορετικές συνθήκες αποθήκευσης (|η*|≥ 1,24 MPa·s για ω=0,1 1/s σε t=90d στους 45 ℃). Όσο για τους συντελεστές αποθήκευσης (G’) και απώλειας (G’’), ίσχυσε η σχέση G’> G’’ για όλο το εύρος γωνιακών συχνοτήτων που μετρήθηκαν υποδεικνύοντας την ύπαρξη σταθερού σκευάσματος. Όσον αφορά στο ενθυλακωμένο εκχύλισμα φύλλων τομάτας σε μορφή μεμβράνης, αυτό χρησιμοποιήθηκε ως επικάλυψη σε φιλμ λεπτού υμενίου (διαξονικά προσανατολισμένο φιλμ πολυπροπυλενίου) προς το σχηματισμό ενός διστρωματικού φιλμ συσκευασίας. Τα δύο στρώματα σταθεροποιήθηκαν μεταξύ τους μέσω χημικής και ήπιας θερμικής κατεργασίας. Το τελικό φιλμ αξιολογήθηκε ως προς τη μορφολογία των ινών που εμφανίστηκαν πεπλατυσμένες λόγω της κατεργασίας που υπέστησαν, χωρίς ωστόσο να παρατηρηθεί κατάρρευση της δομής τους και με την παρατήρηση, μικρής μόνο απώλειας ενθυλακωμένου εκχυλίσματος (≈4,6%). Το παραγόμενο φιλμ χρησιμοποιήθηκε για την συσκευασία τομάτων σε σχέση με απλό φιλμ πολυπροπυλενίου. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους 5, σε θερμοκρασία δωματίου και στους 45 ℃ και διενεργούταν καθημερινή δειγματοληψία και μέτρηση χρώματος, απώλειας βάρους, pH, ολικού βακτηριακού φορτίου- ζυμών/μούχλας καθώς και οργανοληπτικός έλεγχος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι καρποί που συσκευάστηκαν με το διστρωματικό φιλμ ανέπτυξαν βραδύτερα μικροβιακό φορτίο, οδηγώντας σε παράταση του χρόνου ζωής κατά 1-3 ημέρες. Τέλος παρατέθηκε μελέτη αξιολόγησης του κύκλου ζωής (ΑΚΖ) για το καλλυντικό σκεύασμα και το φιλμ συσκευασίας με ενθυλακωμένα βιοδραστικά συστατικά ως προς το περιβαλλοντικό αποτύπωμα των διεργασιών που απαιτήθηκαν σε σχέση με την παραγωγή συμβατικών υλικών. Αναφορικά με την καλλυντική κρέμα η ΑΚΖ εστιάστηκε στην παραγωγή της κρέμας και την ενθυλάκωση με τη μελέτη να δείχνει την αύξηση του περιβαλλοντικού αποτυπώματος με την προσθήκη του εγκλεισμένου βιοδραστικού συστατικού. Αντίστοιχα για το κόστος παραγωγής, εκτιμήθηκε μία αύξηση κατά 0,045 €/καλλυντικό σκεύασμα για την κρέμα με το βιοδραστικό συστατικό ενώ η εκτίμηση κόστους παραγωγής για μια απλή κρέμας βάση ήταν στα 0,20 €/καλλυντικό σκεύασμα. Ωστόσο, στη μελέτη αυτή δεν έχουν συμπεριληφθεί δεδομένα αποτελεσματικότητας από τη χρήση της ουσίας. Όσον αφορά στο φιλμ συσκευασίας, συγκρίθηκε το περιβαλλοντικό αποτύπωμα της ενεργής συσκευασίας με αυτό του συμβατικού φιλμ λεπτού υμενίου για όλα τα στάδια από την συγκομιδή των φύλλων μέχρι και το αποτέλεσμα χρήσης τους. Η λειτουργική μεμβράνη επέδειξε καλύτερες περιβαλλοντικές επιδόσεις σε όλα τα στάδια της εφοδιαστικής αλυσίδας με εξαίρεση το στάδιο παραγωγής του σε σχέση με το απλό φιλμ, επιβάρυνση που αντισταθμίζεται από τα οφέλη της αξιοποίησης παραπροϊόντων του αγρού προς τη δημιουργία υλικών προστιθέμενης αξίας αλλά και της παράτασης του χρόνου ζωής του συσκευασμένου προϊόντος. Ως προς την οικονομική εκτίμηση, το κόστος παραγωγής του διστρωματικού φιλμ υπολογίστηκε να αυξηθεί κατά 0,36 €/kg φιλμ.