Μικρορευστομηχανικές διατάξεις για τη μελέτη της συμπεριφοράς κυττάρων: μικροδιάταξη μυελού των οστών σε ψηφίδα (bone marrow-on-a-chip)

Abstract

Organs-on-chips (OoCs) is a rising field that has emerged in the last decades at the crossroads of microfluidic technology and cell biology, managing to become the epitome of biomimetic systems. They are reliable preclinical models, responding to modern challenges in the field of biomedicine and biological research, which are nowadays limited to conventional static cell cultures and animal testing. The bone marrow, due to its vital role in the human body with the process of hematopoiesis, is a key study organ. Thus, the development of bone marrow-on-a-chip (BMoC) is important for understanding the biology of the organ itself, mapping related diseases, such as multiple myeloma and leukemia, and finally, for identifying cells’ response to drugs, radiation and chemotherapy. In this context, the present PhD thesis aims to develop a bone marrow-on-a-chip device for the purely in vitro and scaffold-free generation and maintenance of the human bone marrow perivascular hematopoietic niche. First, all stages of the device construction have been developed, from the design to its sealing, which led to a successful and repeatable completion of the device. It consists of two cylindrical poly(dimethylsiloxane) (PDMS) microchambers, one for medium perfusion and one for cell culture, which communicate with each other through an intervening porous membrane, while the whole assembly is sealed with glass. The primary methods used for its construction were soft lithography (replica molding) and surface treatment using plasma technology. Also, a successful and reproducible PDMS membrane fabrication protocol was proposed, relying on two main aspects, i.e. chemical surface passivation, and mechanical strength enhancement. In order to simplify and speed up the device manufacturing process, the incorporation of a commercial polyethylene terephthalate (PET) polyester membrane was finally chosen. Aiming to achieve long-term cell culture on the BMoC device, a one-step, simple method of surface modification of the PDMS-based microdevices prior to collagen coating was suggested, in order to address the inherent hydrophobicity of the material. This is air plasma pre-treatment, a step already built into the device manufacturing process at the bonding stage. Testing of mesenchymal stem cells (MSCs) culture in microchambers treated with the proposed method, a task little examined in the research community, revealed enhanced cell growth and complete surface coverage on the 5th day, the longest in the existing literature. The abovementioned contribute to the suitability of the plasma pre-treatment method for the immobilization of collagen in PDMS-based microdevices, for the purpose of long-term culture of MSCs. In order to optimize the operation of the microdevice under flow (active perfusion), the phenomenon and causes of bubble formation at low and high flows were studied, and improvement actions were investigated to limit it, but also to eliminate it by incorporating a commercial bubble trap. Overall, bubble formation is shown to be intrinsic to the operation of a microfluidic system under flow for long periods of time, and in particular, to the device assembly itself, meaning the device material, its components and wiring, but also, to the temperature/pressure gradients between the feed and the device. For this reason, a passively perfused BMoC device is finally proposed. The device is embedded with the commercial PET membrane, which showed greater uniformity of MSCs growth when compared with the PDMS membrane. Further, the BMoC devices under flow and passively perfused were compared, both with the PET membrane incorporated, where a faster and uneven growth of MSCs was demonstrated in the former, and a smoother and more uniform in the latter. Due to bubble formation in microdevices under flow, passive perfusion of the BMoC was chosen to ensure a uniformly organized supportive stromal tissue before the HSCs introduction. Thus, co-culture of MSCs with hematopoietic stem cells (HSCs) in the passively perfused BMoC, purely in vitro and scaffold-freely for 3 days, demonstrated the ability of the device to maintain and proliferate HSCs, towards the generation of a hematopoietic bone marrow organoid. Finally, design results of a microdevice with three integrated cell culture microchambers are presented, for the parallel conduct of three simultaneous experiments, as part of future plans of the thesis. The geometry of the perfusion microchambers is investigated both analytically and computationally, in order to ensure the filling and equal operation of all three microchambers.

Οι μικροδιατάξεις οργάνων σε ψηφίδα (organs-on-chips/OoCs) έχουν αναδειχθεί τις τελευταίες δεκαετίες από το γόνιμο συγκερασμό της μικρορευστονικής τεχνολογίας με την κυτταρική βιολογία, αποτελώντας την επιτομή των βιομιμητικών συστημάτων. Αποτελούν αξιόπιστα προκλινικά μοντέλα, δίνοντας απάντηση στις σύγχρονες προκλήσεις στον τομέα της βιοϊατρικής και της βιολογικής έρευνας, που σήμερα περιορίζονται σε συμβατικές στατικές κυτταροκαλλιέργειες και σε πειράματα σε ζώα. Ο μυελός των οστών, λόγω του ζωτικού ρόλου του στον ανθρώπινο οργανισμό με το μηχανισμό της αιμοποίησης, αποτελεί βασικό όργανο μελέτης. Έτσι, η ανάπτυξη μικροδιάταξης μυελού των οστών σε ψηφίδα (bone marrow-on-a-chip/BMoC) αποτελεί σημαντικό εργαλείο για την κατανόηση της βιολογίας του ίδιου του οργάνου, τη χαρτογράφηση σχετιζόμενων ασθενειών, όπως το πολλαπλό μυέλωμα και η λευχαιμία, και τέλος, για τον έλεγχο απόκρισης των κυττάρων του σε φάρμακα, ακτινοβολία και χημειοθεραπείες. Σε αυτό το πλαίσιο, η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στην ανάπτυξη μιας μικροδιάταξης μυελού των οστών σε ψηφίδα για την αμιγώς in vitro και απουσία ικριωμάτων δημιουργία και συντήρηση της ανθρώπινης περιαγγειακής αιμοποιητικής περιοχής του μυελού. Αρχικά, αναπτύσσονται όλα τα στάδια κατασκευής της μικροδιάταξης, από το σχεδιασμό μέχρι και τη σφράγισή της, που οδήγησαν σε επιτυχή και επαναλήψιμη ολοκλήρωση της μικροδιάταξης. Αυτή αποτελείται από δύο κυλινδρικούς μικροθαλάμους πολυ(διμεθυλοσιλοξάνης) (PDMS), ένα για την τροφοδοσία με θρεπτικό υλικό και ένα για την καλλιέργεια κυττάρων, τα οποία επικοινωνούν μεταξύ τους μέσω παρεμβαλλόμενης πορώδους μεμβράνης, με την όλη διάταξη να σφραγίζεται με γυαλί. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για την υλοποίησή της ήταν λιθογραφία μαλακής ύλης (τεχνική αντιγραφής μήτρας – replica molding) και επιφανειακή τροποποίηση με χρήση τεχνολογίας πλάσματος. Προτάθηκε πρωτόκολλο επιτυχούς και επαναλήψιμης κατασκευής πορώδους μεμβράνης PDMS, στηριζόμενο σε δύο βασικούς πυλώνες, τη χημική επιφανειακή τροποποίηση και την ενίσχυση της μηχανικής της αντοχής. Για λόγους απλούστευσης και επιτάχυνσης της παραγωγικής διαδικασίας μικροδιατάξεων, μελετήθηκε και επιλέχθηκε τελικά η ενσωμάτωση εμπορικής μεμβράνης πολυεστέρα τερεφθαλικού πολυαιθυλένιου (PET). Στοχεύοντας στην επίτευξη μακροπρόθεσμης καλλιέργειας κυττάρων στη μικροδιάταξη, προτάθηκε μονοβηματική, απλή μέθοδος επιφανειακής τροποποίησης μικροδιατάξεων βασισμένων σε PDMS πριν την επίστρωση κολλαγόνου, προς αντιμετώπιση της εγγενούς υδροφοβικότητας του υλικού. Πρόκειται για την προκατεργασία με πλάσμα αέρα, ένα βήμα ήδη ενσωματωμένο στην κατασκευαστική διαδικασία της μικροδιάταξης στο στάδιο της σφράγισης. Δοκιμή καλλιέργειας μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων (MSCs) σε μικροθαλάμους κατεργασμένους με την προτεινόμενη μέθοδο, εγχείρημα ελάχιστα δοκιμασμένο στην ερευνητική κοινότητα, ανέδειξε ενισχυμένη κυτταρική ανάπτυξη και πλήρη επιφανειακή κάλυψη την 5η ημέρα, τη μεγαλύτερη στη βιβλιογραφία. Τα παραπάνω συντελούν στην καταλληλότητα της μεθόδου προκατεργασίας με πλάσμα για την ακινητοποίηση κολλαγόνου σε βασισμένες σε PDMS μικροδιατάξεις, με σκοπό τη μακροπρόθεσμη καλλιέργεια MSCs. Για τη βελτιστοποίηση της λειτουργίας της μικροδιάταξης υπό ροή (ενεργή τροφοδοσία), μελετήθηκε το φαινόμενο και τα αίτια δημιουργίας φυσαλίδων σε χαμηλές και υψηλές ροές, και διερευνώνται βελτιωτικές ενέργειες για τον περιορισμό του, αλλά και την εξαφάνισή του με την ενσωμάτωση εμπορικής παγίδας. Συνολικά αποδεικνύεται ότι η δημιουργία φυσαλίδων είναι συνυφασμένη με τη λειτουργία ενός μικρορευστονικού συστήματος υπό ροή για μεγάλα χρονικά διαστήματα, και συγκεκριμένα, με την ίδια τη διάταξη, το υλικό, τα εξαρτήματα και τη συνδεσμολογία της, αλλά και τις βαθμίδες θερμοκρασίας/πίεσης μεταξύ τροφοδοσίας και μικροδιάταξης.Για το λόγο αυτό, προτείνεται τελικά μικροδιάταξη παθητικής τροφοδοσίας με ενσωματωμένη εμπορική μεμβράνη PET. Προς επιβεβαίωση της επιλογής μεμβράνης PET, σε σύγκρισή της με την κατασκευασμένη PDMS, αυτή εμφάνισε μεγαλύτερη ομοιομορφία ανάπτυξης MSCs. Με ενσωμάτωση της μεμβράνης PET λοιπόν, συγκρίθηκαν μεταξύ τους οι μικροδιατάξεις υπό ροή και παθητικής τροφοδοσίας, όπου αποδείχθηκε ταχύτερη αλλά ανομοιογενής ανάπτυξη MSCs στην πρώτη, και περισσότερο ομαλή και ομοιόμορφη στη δεύτερη. Λόγω του προβλήματος εισόδου φυσαλίδων στη μικροδιάταξη υπό ροή, επιλέχθηκε εκείνη της παθητικής τροφοδοσίας για την εξασφάλιση ομοιόμορφου υποστηρικτικού στρωματικού ιστού πριν την εισαγωγή HSCs. Έτσι, συγκαλλιέργεια των MSCs με αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs), αμιγώς in vitro και απουσία ικριωμάτων για 3 ημέρες, απέδειξε την ικανότητα της μικροδιάταξης να συντηρήσει και να πολλαπλασιάσει τα HSCs, στην κατεύθυνση της δημιουργίας ενός αιμοποιητικού οργανοειδούς μυελού των οστών. Τέλος, παρουσιάζονται αποτελέσματα σχεδιασμού μικροδιάταξης με ενσωματωμένους τρεις μικροθαλάμους καλλιέργειας, για την παράλληλη διεξαγωγή 3 ταυτόχρονων καλλιεργειών υπό ροή, ως μέρος μελλοντικών επεκτάσεων της διατριβής. Η γεωμετρία των μικροθαλάμων τροφοδοσίας διερευνήθηκε τόσο αναλυτικά όσο και υπολογιστικά, ώστε να εξασφαλίζεται πλήρωση και ισότιμη λειτουργία και των τριών μικροθαλάμων.