Εφαρμογές σύγχρονων ενόργανων αναλυτικών τεχνικών στην κλινική και δικαστική τοξικολογία

Abstract

This PhD thesis is divided into three sections. In the first, a GC-MS method for the determination of NSAIDs in serum was developed. The NSAIDs are being widely consumed and are sold over the counter and that’s why there are many intoxication cases, especially in children. In this study, the sample preparation was first studied and optimized. A liquid-liquid extraction was selected and for the extraction step pH=3,7 was found the most efficient for the majority of the studied NSAIDs. Afterwards, different derivatization protocols were studied and BSTFA with 1% TMCS was found to be the optimum choice for the majority of the examined NSAIDs. In this study the formation of DCF-lactam was also thoroughly examined. In the next section, the in vitro toxicity of cocaine was examined using a metabolomic approach, both in human liver cancer cells and in normal mice neural progenitor cells, NPCs. First, the effect of cocaine on HepG2 cells was examined and the IC50 with XTT was experimentally calculated at 2.428 mM. Then, the metabolomic profile of HepG2 cells was studied after exposure to cocaine at a concentration of 2 mM at three time points (3h, 24h and 48h). Intracellular and extracellular fluid samples were afterwards analyzed by a validated HILIC-MS/MS method for targeted metabolomic analysis using an amide column (ACQUITY) and gradient elution with the triple quadrupole operating in MRM mode. Then a non-targeted analysis was performed with gas chromatography coupled with mass spectrometry following the method of Fiehn. Targeted and untargeted metabolomic analysis succeeded in revealing metabolomic changes after cocaine exposure but deciphering the exact cytotoxic mechanism of cocaine is still a challenge. The same experiment was then performed in muscle neural progenitor cells and the IC50 was first calculated at 5.48 mM cocaine. The same procedure as applied to HepG2 cells was followed and similar results were obtained. In the third section of the PhD thesis, a method for alkaline drugs in DBS with SPE-LC-MS/MS was developed. Initially the drying time of DBS was studied. The method was then developed, validated and applied to real samples. Only 10 µL were needed to create the DBSs and the necessary drying time was estimated to be under one hour. The method was validated for extraction recovery, linear range, detection limits, precision and repeatability, and stability on the autosampler. After validation of the method, whole blood samples that had been previously analyzed one year ago were re-analyzed and the results were comparable for all the compounds except for 6-MAM. High sensitivity and high recovery in the extraction step are necessary and for this reason further optimization of the method is necessary to increase the recovery of opiates.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή χωρίζεται σε τρεις ενότητες. Στην πρώτη έγινε μελέτη των ΜΣΑΦ, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως χωρίς ιατρική συνταγή και γι’ αυτό το λόγο ετησίως καταγράφονται αρκετά περιστατικά δηλητηρίασης, κυρίως σε μικρά παιδιά. Σε αυτή την εργασία αναπτύχθηκε μια μέθοδος στην οποία μελετήθηκε ο βαθμός εκχύλισης των ΜΣΑΦ στον ορό του αίματος και στη συνέχεια ο ακριβής προσδιορισμός τους. Αρχικά, εξετάστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης (pH) και ακολούθως οι διαφορετικές συνθήκες παραγωγοποίησης για τον προσδιορισμό των ΜΣΑΦ. Το BSTFA με 1% TMCS επιλέχθηκε ως το βέλτιστο αντιδραστήριο παραγωγοποίησης για την πλειοψηφία των ΜΣΑΦ, ενώ το pH που επιλέχθηκε ως καταλληλότερο για την εκχύλιση των ΜΣΑΦ από τον ορό αίματος ήταν το 3,7. Επίσης, μελετήθηκε εκτενώς ο σχηματισμός της DCF-lactam, η οποία σχηματίζεται στον ορό του αίματος, αλλά και στον θάλαμο εισαγωγής του δείγματος λόγω υψηλής θερμοκρασίας. Στην επόμενη ενότητα εξετάστηκε η in vitro τοξικότητα της κοκαΐνης με μεταβολομική προσέγγιση, τόσο σε ανθρώπινα καρκινικά ηπατικά κύτταρα, όσο και σε φυσιολογικά νευρικά προγονικά κύτταρα μύων. Αρχικά, εξετάστηκε η επίδραση της κοκαΐνης σε κύτταρα HepG2 και υπολογίστηκε πειραματικά η IC50 με XTT στα 2,428 mM. Στη συνέχεια, μελετήθηκε το μεταβολομικό προφίλ των κυττάρων HepG2 μετά από επίδραση με κοκαΐνη σε συγκέντρωση 2 mM σε τρία χρονικά σημεία (3h, 24h και 48h). Τα δείγματα του ενδοκυττάριου και του εξωκυττάριου υγρού ακολούθως αναλύθηκαν με επικυρωμένη μέθοδο HILIC-MS/MS για στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση χρησιμοποιώντας στήλη αμιδίου (ACQUITY) και βαθμωτή έκλουση με το τριπλό τετράπολο να λειτουργεί σε μέθοδο MRM. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μη στοχευμένη ανάλυση με αέρια χρωματογραφία συζευγμένη με φασματομετρία μαζών ακολουθώντας την μέθοδο του Fiehn. Η στοχευμένη και η μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση κατάφερε να αποκαλύψει μεταβολομικές αλλαγές μετά από επίδραση με κοκαΐνη, αλλά η αποκωδικοποίηση του ακριβούς κυτταροτοξικού μηχανισμού της κοκαΐνης εξακολουθεί να είναι μια πρόκληση. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε το ίδιο πείραμα σε νευρικά προγονικά κύτταρα μύων και υπολογίστηκε αρχικά η IC50 στα 5,48 mM κοκαΐνης. Ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία που εφαρμόστηκε και για τα HepG2 κύτταρα και προέκυψαν παρόμοια αποτελέσματα. Οι μεταβολίτες που επηρεάστηκαν από την κοκαΐνη ήταν οι ίδιοι με αυτούς που βρέθηκαν στα κύτταρα HepG2 εκτός από την αδενίνη, αδενοσίνη, λευκίνη, ισολευκίνη και πουτρεσκίνη, οι οποίες βρέθηκαν να διαφοροποιούνται μόνο στα NPCs.Στην τρίτη ενότητα της διδακτορικής διατριβής έγινε ανάπτυξη μεθόδου αλκαλικών ναρκωτικών σε DBS με SPE-LC-MS/MS. Αρχικά μελετήθηκε ο χρόνος ξήρανσης της ξηρής κηλίδας. Στη συνέχεια έγινε ανάπτυξη, επικύρωση και εφαρμογή της μεθόδου σε πραγματικά δείγματα. Για την δημιουργία των DBS χρειάστηκαν μόνο 10 μL και ο απαραίτητος χρόνος ξήρανσης υπολογίστηκε κάτω από μία ώρα. Η μέθοδος επικυρώθηκε για ανάκτηση στο στάδιο της εκχύλισης, γραμμική περιοχή, όρια ανίχνευσης, ακρίβεια, επαναληψιμότητα και σταθερότητα. Μετά από την επικύρωση της μεθόδου αναλύθηκαν πραγματικά δείγματα ολικού αίματος, τα οποία είχαν αναλυθεί πριν από ένα έτος και τα αποτελέσματα ήταν συγκρίσιμα εκτός από την ουσία 6-ΜΑΜ. Απαραίτητη είναι η υψηλή ευαισθησία και η υψηλή ανάκτηση στο στάδιο της εκχύλισης και για αυτόν το λόγο είναι αναγκαία η περαιτέρω βελτιστοποίηση της μεθόδου, ώστε να αυξηθεί η ανάκτηση των οπιούχων.