Μελέτη επιγενετικών μηχανισμών στη χημειοανθεκτικότητα του τριπλά αρνητικού καρκίνου του μαστού

Abstract

Breast cancer is the most frequently diagnosed malignancy in women worldwide and the heterogeneity of the disease is an obstacle for the development of effective treatments that will lead to the definitive elimination of these tumors. Triple negative breast cancer (TNBC) is characterized by the absence of estrogen, progesterone and human epidermal growth factor 2 receptors, and is the most aggressive type of breast cancer with poor survival and prognosis. Due to the lack of identified molecular targets, chemotherapy is the standard treatment for TNBC, but, despite a good initial response, many patients will develop resistance and tumor recurrence. TNBC tumors possess a wide range of chemoresistance mechanisms,including deregulated epigenetic mechanisms. Understanding these mechanisms could lead to the development of new targeting approaches that may be more effective against chemoresistant cells. In the present study, we have developed and characterized two paclitaxel-resistant TNBC cell lines (SUM159 and BT-549) to investigate epigenetic mechanisms that may be implicated in the development of chemoresistance and identify potential targets. Characterization of resistant cell lines, including transcriptome analysis, revealed several of the "classical" mechanisms of chemoresistance. Over-expression of epigenetic regulators in chemoresistant cell lines, related to DNA methylation and histone deacetylation, lead to inhibition experiments of these processes. Our results showed that DNA methylation and histone deacetylation contribute to the chemoresistance of SUM159 and BT-549 cells, respectively. Analysis of chromatin accessibility by ATAC-sequencing demonstrated significant differences between parental and resistant cells. In the case of SUM159 PTX-res cells, changes in chromatin accessibility are accompanied by corresponding changes in H3K27ac levels,further supporting our hypothesis that the expression of the closest genes is under epigenetic regulation. Pathway enrichment analysis, after integration of RNA-seq, ATAC-seq and H3K27acChip seq data, showed that the Epithelial-to Mesenchymal Transition (EMT) was one of themost overrepresented biological processes in the SUM159 chemoresistant cells. ChIP-seq experiments for p63 transcription factor revealed the collapse of p63 cistrome in these cells, with a simultaneous reduction in chromatin accessibility. Typically, the closest genes which are downregulated in chemoresistant SUM159 cells, concern the regulation of an epithelial phenotype, in agreement with the main role of p63 as a master regulator of epidermal growth. The above results suggest, that the process of EMT, which is probably promoted by the suppression of p63, plays an important role in the chemoresistance of this subtype of TNBC. Targeted anti-EMT drugs could re-sensitize these cells to paclitaxel.

Ο καρκίνος του μαστού είναι η πιο συχνά διαγνωσθείσα κακοήθεια στις γυναίκες παγκοσμίως και η ετερογένεια της νόσου αποτελεί εμπόδιο στην ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπειών, που θα οδηγήσουν στην οριστική εξάλειψη των όγκων αυτών. Οι στοχευμένες θεραπείες έχουν βελτιώσει σημαντικά την πρόγνωση σε έναν μεγάλο αριθμό ασθενών, ωστόσο αποδεικνύονται ανεπαρκείς σε γυναίκες με τριπλά αρνητικό καρκίνο μαστού (ΤΑΚΜ). Ο ΤΑΚΜ χαρακτηρίζεται από την απουσία των υποδοχέων οιστρογόνων, προγεστερόνης και του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα 2, και αποτελεί τον πιο επιθετικό τύπο καρκίνου του μαστού με χαμηλή συνολική επιβίωση και κακή πρόγνωση. Λόγω της έλλειψης αναγνωρισμένων μοριακών στόχων, η συστημική χημειοθεραπεία αποτελεί το κύριο όπλο καταπολέμησης της νόσου, αλλά παρά την αρχική καλή ανταπόκριση που παρουσιάζουν οι ασθενείς, πολλοί από αυτούς θα αναπτύξουν αντίσταση, με αποτέλεσμα την υποτροπή του όγκου και τη μετάσταση. Οι όγκοι ΤΑΚΜ διαθέτουν ένα ευρύ φάσμα μηχανισμών ανθεκτικότητας στα χημειοθεραπευτικά φάρμακα, συμπεριλαμβανομένων και των απορυθμισμένων επιγενετικών μηχανισμών. Η μελέτη των επιγενετικών διαφορών μεταξύ των χημειοευαίσθητων και των χημειοανθεκτικών κυττάρων του ΤΑΚΜ, θα μπορούσε να συμβάλει στην ανάπτυξη νέων αποτελεσματικότερων θεραπειών που θα οδηγήσουν στην πλήρη εξάλειψη του όγκου. Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκαν και χαρακτηρίστηκαν δύο ανθεκτικές στην πακλιταξέλη κυτταρικές σειρές του ΤΑΚΜ από τις SUM159 και BT-549, με σκοπό τη διερεύνηση των επιγενετικών μηχανισμών που πιθανώς εμπλέκονται στην ανάπτυξη χημειοανθεκτικότητας. Ο χαρακτηρισμός των ανθεκτικών κυτταρικών σειρών, συμπεριλαμβανομένης και ανάλυσης του μεταγραφώματος, ανέδειξε αρκετούς από τους «κλασσικούς» μηχανισμούς χημειοανθεκτικότητας. Η υπερ-έκφραση επιγενετικών ρυθμιστών στις χημειοανθεκτικές κυτταρικές σειρές, που σχετίζονται με τη μεθυλίωση τουDNA και την αποακετυλίωση ιστονών, μας οδήγησε στην διεξαγωγή πειραμάτων αναστολής των διαδικασιών αυτών. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι οι διαδικασίες αυτές διαδραματίζουν κάποιο ρόλο στην ανθεκτικότητα των SUM159 και BT-549 κυττάρων. Η ανάλυση της προσβασιμότητας της χρωματίνης, μέσω ATAC-sequencing, αποκάλυψε σημαντικές διαφορές μεταξύ των ανθεκτικών και των αντίστοιχων πατρικών κυτταρικώνσειρών, κάτι το οποίο υποδηλώνει ότι επιγενετικοί μηχανισμοί εμπλέκονται στη χημειοανθεκτικότητα. Στην περίπτωση των SUM159 PTX-res κυττάρων μάλιστα, αλλαγές στην προσβασιμότητα της χρωματίνης συνοδεύονται από αντίστοιχες αλλαγές στα επίπεδα της H3K27ac, ενισχύοντας περαιτέρω την υπόθεσή μας ότι η έκφραση των παρακείμενων γονιδίων είναι υπό επιγενετική ρύθμιση. Συνδυαστική ανάλυση των δεδομένων του RNA-seq, ATAC-seq και Chip-seq ανέδειξε τον εμπλουτισμό της βιολογικής διαδικασίας του EMT (Epithelial to Mesenchymal Transition) στα χημειοανθεκτικά SUM159 κύτταρα. Chip-seq πειράματα για τον μεταγραφικό παράγοντα p63 έδειξαν την κατάρρευση των θέσεων πρόσδεσής του στα κύτταρα αυτά με ταυτόχρονη μείωση της προσβασιμότητας της χρωματίνης. Είναι χαρακτηριστικό ότι παρακείμενα γονίδια, που υποεκφράζονται στα χημειοανθεκτικά SUM159 κύτταρα, αφορούν τη ρύθμιση ενός επιθηλιακού φαινοτύπου, σε συμφωνία με τον κύριο ρόλο του p63 σαν master regulator της επιδερμικής ανάπτυξης. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποστηρίζουν ότι, η διαδικασία του EMT, η οποία πιθανώς προάγεται από την καταστολή του p63, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη χημειοανθεκτικότητα αυτού του υπότυπου του ΤΑΚΜ. Στοχευτικά φάρμακα κατά του ΕΜΤ θα μπορούσαν να επανευαισθητοποιήσουν τα κύτταρα αυτά στην πακλιταξέλη.