Ανάπτυξη κλινικών δεικτών αξιόπιστης εκτίμησης κινδύνου για εμφάνιση αθηροσκληρωτικών νόσων στον άνθρωπο

Abstract

The present doctorate thesis has led to the development of simple and innovative methodologies for the isolation, characterization and fractionation of low density lipoproteins (LDLs) into their main molecular components. The ultimate aim of this thesis is to study/measure the specific oxidative modifications present on LDL components, that characterize the oxidized LDL (oxLDL) particles, which in turn are causally related to the development of atheromatous plaques and therefore to the risk of subsequent cardiovascular diseases (CVDs). The methods developed in the present thesis include: (a) A simple, relatively fast and low-cost method for the isolation of LDL particles (LDLP)from human blood serum, in order to avoid the disadvantages of the currently used ultracentrifugation and affinity chromatography methods. (b) Confirmation of the purity of the, isolated with the proposed methodology, LDL-P through SDS-PAGE electrophoresis of their protein component (apolipoprotein B100, apoB100), and determination of the size of LDL-P. The latter as well as the concentration of LDL-P in serum are estimated by means of a developed simple, clinically applicable - in comparison with existing nuclear magnetic resonance (NMR)methodologies - method while their value as risk indicators for the development of CVDs is also evaluated. (c) A method for the fractionation of LDL, for the first time, into its individual protein/lipid (apoB100, cholesterol esters, triglycerides, free cholesterol, phospholipids) and antioxidant (carotenoids, tocopherols) components. (d) Methods for the quantification, for the first time, of certain specific - representative of the initial effects of oxidative stress - oxidative modifications/markers in the molecular components of LDL (cholesteryl ester-OOH, triglyceride-OOH, free cholesterol-OOH, phospholipid-OOH, apoB100- MDA, apoB100-DiTyr), out of the many (known/unknown/under development) oxidative modifications that collectively characterize the oxidative state of oxLDL. These methods for oxLDL state evaluation differ significantly when compared to the existing non-specific and unreliable methods for assessing the oxidative status ofoxLDL. The aforementioned oxLDL markers are being studied for the first time in patients prone to atherosclerosis development as well as in patients with established atherosclerotic lesions and CVDs. Specifically, the selected patient groups include: patients with chronic kidney disease(CKD) on hemodialysis, patients with CKD on peritoneal dialysis, patients with abdominal aortic aneurysm patients and patients with carotid artery disease. Additionally, within the framework of the present thesis, a structural study of the apoB100 protein of LDL particles was carried out, as this remains a poorly studied protein with an unknown structure. Initially, a biophysical characterization of the solubilized apoB100 was performed by studying its secondary structure (by circular dichroism analysis, CD analysis), its thermal stability (by differential scanning fluorescence, nanoDSF) and the existence of aggregates in its solution (by dynamic scattering light, DLS). The biophysical characterization of apoB100 was followed by LCP (Liquid Cubic Phase) crystallization screens of the protein and measurement of the resulting crystals by X-ray diffraction. In summary, the isolation of LDL particles and their fractionation into their individual protein, lipid and antioxidant components paves the way for future studies regarding the investigation and quantification of all possible LDL oxidative modifications and thus paves the way for the full characterization of the so far unknown oxidative status of oxLDL particles. This may also lead to further studies for the identification of the oxLDL modifications that are responsible for their recognition by the macrophages and the impending transformation of the latter into foam cells, which are responsible for the formation of atherosclerotic lesions that in turn lead to the development of CVDs. Lastly, the biophysical characterization experiments and the LCP crystallization screens of apoB100, performed for the first time in the framework of this thesis, are the trigger for further apoB100 crystallization studies that will lead to the solving the so far unknown structure of apoB100 and to the elucidation its function and role in the development of atherosclerotic lesions.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή οδήγησε στην ανάπτυξη απλών και καινοτόμων μεθοδολογιών για την απομόνωση, το χαρακτηρισμό και την κλασμάτωση των λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας (LDL) στα κύρια μοριακά τους συστατικά. Απώτερος σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη σε αυτά συγκεκριμένων οξειδωτικών τροποποιήσεων οι οποίες χαρακτηρίζουν τα αιτιακώς σχετιζόμενα με την ανάπτυξη αθηρωματικών πλακών και άρα και με τον κίνδυνο εμφάνισης των επακόλουθων καρδιαγγειακών παθήσεων, οξειδωμένα LDL (oxLDL) σωματίδια. Οι αναπτυχθείσες στην παρούσα διατριβή μέθοδοι περιλαμβάνουν: (α) Μία απλή, σχετικά γρήγορη και χαμηλού κόστους μέθοδο για την απομόνωση των LDL σωματιδίων (LDL-P) από τον ορό του αίματος, προς αποφυγή των μειονεκτημάτων των έως τώρα εφαρμοζόμενων υπερφυγοκεντρικών μεθόδων και μεθόδων χρωματογραφίας συγγένειας. (β) Επιβεβαίωση της καθαρότητας των απομονωμένων με την προτεινόμενη μεθοδολογία LDL, μέσω SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης της πρωτεΐνης αυτών (απολιποπρωτεΐνη Β100, apoB100), και προσδιορισμός του μεγέθους των LDL-P. Το τελευταίο καθώς και η συγκέντρωση των LDL-P στον ορό υπολογίζονται στην παρούσα διατριβή μέσω μίας αναπτυχθείσας απλής, κλινικά εφαρμόσιμης μεθόδου - σε σύγκριση με τις υπάρχουσες μεθοδολογίες μαγνητικού πυρηνικού συντονισμού (NMR) – ενώ αξιολογείται και η αξία τους ως δείκτες εκτίμησης του κινδύνου εμφάνισης καρδιαγγειακών παθήσεων. (γ) Μία μέθοδος για την κλασμάτωση των LDL, για πρώτη φορά, στα επιμέρους πρωτεϊνικά/λιπιδικά (apoB100, εστέρες χοληστερίνης, τριγλυκερίδια, ελεύθερη χοληστερίνη, φωσφολιπίδια) και αντιοξειδωτικά (καροτενοειδή, τοκοφερόλες) συστατικά τους. (δ) Μέθοδοι για την ποσοτικοποίηση, για πρώτη φορά, ορισμένων συγκεκριμένων - αντιπροσωπευτικών των αρχικών επιδράσεων του οξειδωτικούς στρες - οξειδωτικών τροποποιήσεων/δεικτών στα μοριακά συστατικάτων LDL (cholesteryl ester-OOH, triglyceride-OOH, free cholesterol-OOH, phospholipid-OOH,apoB100-MDA, apoB100-DiTyr) εκ των πολλών (γνωστών/άγνωστων/υπό ανάπτυξη) οξειδωτικών τροποποιήσεων που συλλογικά χαρακτηρίζουν την οξειδωτική κατάσταση των oxLDL. Οι μέθοδοι αυτοί έρχονται σε αντίθεση με τις υπάρχουσες μη-εξειδικευμένες και αναξιόπιστες μεθόδους γιατην αξιολόγηση της οξειδωτικής κατάστασης των oxLDL. Οι προαναφερθέντες oxLDL δείκτες μελετώνται για πρώτη φορά σε ασθενείς επιρρεπείς στην εμφάνιση και σε ασθενείς με εγκατεστημένες αθηρωματικές πλάκες και καρδιαγγειακές νόσους. Συγκεκριμένα, οι ομάδες ασθενών που επιλέχθηκαν είναι: ασθενείς με χρόνια νεφρική νόσο υπό αιμοκάθαρση, ασθενείς με χρόνια νεφρική νόσο υπό περιτοναϊκή κάθαρση, ασθενείς με ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής και ασθενείς με στένωση καρωτίδων. Επιπροσθέτως, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε δομική μελέτη της apoB100 των LDL σωματιδίων, καθώς αυτή αποτελεί μέχρι και σήμερα μία πρωτεΐνη ελάχιστα μελετημένη και με άγνωστη δομή. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε χαρακτηρισμός των βιοφυσικών ιδιοτήτων του διαλύματος της apoB100 μέσω μελέτης της δευτεροταγούς της δομής (με ανάλυση κυκλικού διχρωισμού, CD analysis), της θερμικής της σταθερότητας (με διαφορική φθορισμομετρία σάρωσης, nanoDSF) και της ύπαρξης συσσωματωμάτων στο διάλυμα αυτής (μέσω δυναμικής σκέδασης φωτός, DLS). Έπειτα, ακολούθησαν δοκιμές LCP (Liquid Cubic Phase) κρυστάλλωσης της πρωτεΐνης και μέτρηση των προκύψαντων κρυστάλλων με περίθλαση ακτίνων Χ. Συνοψίζοντας, η απομόνωση των LDL σωματιδίων και η κλασμάτωσή τους στα επιμέρους πρωτεϊνικά, λιπιδικά και αντιοξειδωτικά συστατικά τους ανοίγει το δρόμο για μελλοντικές μελέτες διερεύνησης και ποσοτικοποίησης όλων των πιθανών οξειδωτικών τροποποιήσεων των LDL και συνεπώς του πλήρους χαρακτηρισμού της, άγνωστης μέχρι σήμερα, οξειδωτικής κατάστασης των oxLDL σωματιδίων. Το γεγονός αυτό μπορεί να οδηγήσει σε περαιτέρω μελέτες ταυτοποίησης των οξειδωτικών τροποποιήσεων των oxLDL οιοποίες αναγνωρίζονται από τα μακροφάγα και είναι υπεύθυνες για τη μετατροπή των τελευταίωνσε αφρώδη κύτταρα, τα οποία ευθύνονται για το σχηματισμό των αθηρωματικών πλακών που με τη σειρά τους οδηγούν στην εμφάνιση των καρδιαγγειακών παθήσεων. Τέλος, ο βιοφυσικός χαρακτηρισμός και οι δοκιμές LCP κρυστάλλωσης της apoB100, που πραγματοποιήθηκαν για πρώτη φορά στην υπάρχουσα βιβλιογραφία στην παρούσα διατριβή, αποτελούν το έναυσμα για την πραγματοποίηση περαιτέρω μελετών κρυστάλλωσης της apoB100 με στόχο την επίλυση της, άγνωστης μέχρι σήμερα, δομής αυτής και της διαλεύκανσης της λειτουργίας και του ρόλου της στην ανάπτυξη αθηρωματικών πλακών.