Ο ρόλος της εξωκυττάριας μήτρας στην παθογένεια της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης

Abstract

Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) is a chronic, progressive interstitial lung disease of unknown etiology, characterized by the scarring and thickening of the lung tissue. The exact cause of IPF is not fully understood, but it is believed to involve a complex interplay of genetic, environmental, and immune factors. Currently, there is no cure for the disease, and treatment options are limited. Two drugs, pirfenidone and nintedanib, have been approved by the FDA for the treatment of IPF. These drugs have been shown to slow the progression of the disease, and manage symptoms, but they do not fully cure IPF. Fibroblasts and myofibroblasts in IPF demonstrate a pathologic phenotype characterized by uncontrolled proliferation and survival. Fibroblast accumulation has been suggested to rely on their ability to invade the ECM and/or to migrate along it. Critical for these processes is the proteolysis of the ECM through cell’s protrusions known as podosomes. Podosomes and invadopodia (known as invadosomes) are actin rich structures of pericellular proteolytic activity, resulting in ECM degradation. SH3PXD2A (known asTKS5) is a scaffold protein that localizes to, and is required for invadosomes formation. So far, Τks5 has been found highly related with cancer, since induces cell invasion of cancer cells. It is known that lung fibroblasts shared common characteristics with cancer cells, including ECM invasion. So TKS5 and podosomes may be implicated in the pathogenesis of IPF, and therefore we further examined their role. Increased expression of TKS5, was detected in the lung tissue of IPF patients and bleomycin (BLM)-treated mice, correlating with increased collagen type I alpha 1 chain (COL1A1) expression. Τhe profibrotic milieu, TGFβ, as well as the acellular fibrotic ECM, were found to induce TKS5 expression and the formation of prominent podosome rosettes in LFs, culminating in increased ECM invasion. Podosomes were retained ex vivo in the absence of any stimulation, indicating that the formation of TKS5-enabled podosomes is an inherent property of IPF LFs. Haploinsufficient Tks5+/- mice were relatively resistant to BLM-induced pulmonary fibrosis. Disease protection was largely attributable to diminished podosome formation in LFs and decreased ECM invasion, thus indicating TKS5-enabled and podosome-mediated ECM invasion as a major pathogenic mechanism in pulmonary fibrosis. Expression profiling revealed an ECM-podosome cross talk, and pharmacologic connectivity map analysis suggested several inhibitors that could prevent podosome formation and thus pulmonary fibrosis. Among them, inhibition of Src kinase was shown to potently attenuate podosome formation in LFs, ECM invasion, as well as pulmonary fibrosis in post BLM precision cut lung slices, suggesting that pharmacological targeting of TKS5-enabled podosome formation is a very promising therapeutic option in pulmonary fibrosis. In addition, in this dissertation the role of Versican in the pathogenesis of IPF was studied. Versican is a large extracellular matrix (ECM) proteoglycan that is present in various tissues, including the lung. Extracellular matrix is a dynamic structure, consisting of more than 300 proteins, glycosaminoglycans and enzymes, which serves as structural scaffold, and provides the mechanical stability for proper lung function. Dysregulation of ECM composition, structure, stiffness, and abundance contributes to several pathological conditions, including IPF. Due to the numerous indications that ECM is involved in the pathogenesis of IPF, Versican, as an ECM component, could be implicated and therefore we pursued its further study. In silico studies, in human and mouse datasets, unveil upregulated expression of VCAN in IPF patients and murine lungs upon bleomycin induced pulmonary fibrosis. In IPF lungs VCAN is expressed mainly by fibroblasts, macrophages and dendritic cells, where VCAN-expressing LFs were found to belong to a COL1A1-expressing subpopulation In vitro TGFβ was found to stimulate VCAN mRNA and protein levels in human and mouse lung fibroblasts. Moreover, the stiff fibrotic aECM induces Vcan expression in fibroblasts. In in vivo experiments, Vcan was found increased in lungs of WT mice with bleomycin induced PF. Immunohistochemistry revealed increased levels of Vcan protein in bronchial epithelium, fibrotic areas and macrophages. To further dissect the role of Vcan in IPF, the BLM induced PF model performed in Vcan+/- mice. Heterozygous genetic deletion of Vcan leads to exacerbated pulmonary fibrosis phenotype in mice. Also, isolation of haplo-insufficient Vcan+/- primary LFs revealed differences in basic cell functions, while TGF-β1 stimulation, affects the mRNA expression of fibrogenic genes and induces the formation of podosome rosettes, leading in increased invasion. In conclusion, disease exacerbation in Vcan+/- mice was correlated with disturbed ECM homeostasis, modulation of TGFβ responses, increased fibroblasts adhesion and the formation of podosomes leading in increased ECM migration and invasion.

Η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση (ΙΠΙ) είναι μια χρόνια, προοδευτική διάμεση πνευμονοπάθεια άγνωστης αιτιολογίας, η οποία χαρακτηρίζεται από σχηματισμό ουλών και πάχυνση του πνευμονικού ιστού. Η ακριβής αιτία της ΙΠΙ δεν είναι πλήρως κατανοητή, αλλά πιστεύεται ότι περιλαμβάνει μια πολύπλοκη αλληλεπίδραση γενετικών, περιβαλλοντικών και ανοσολογικών παραγόντων. Επί του παρόντος, δεν υπάρχει αποτελεσματική θεραπεία για την ασθένεια και οι θεραπευτικές επιλογές είναι περιορισμένες. Δύο φάρμακα, η πιρφενιδόνη και το nintedanib, έχουν εγκριθεί από τον FDA για τη θεραπεία της ΙΠΙ. Τα φάρμακα αυτά επιβραδύνουν την εξέλιξη και συμβάλλουν στην διαχείριση των συμπτωμάτων, παρόλα αυτά δεν θεραπεύουν πλήρως την ΙΠΙ.Οι ινοβλάστες και οι μυοϊνοβλάστες στην ίνωση παρουσιάζουν έναν παθολογικό φαινότυπο που χαρακτηρίζεται από ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό και επιβίωση. Η συσσώρευση ινοβλαστών έχει προταθεί ότι βασίζεται στην ικανότητα τους να εισβάλλουν στην ECM και/ή να μεταναστεύουν κατά μήκος της. Κρίσιμη για αυτές τις διαδικασίες είναι η πρωτεόλυση της ECM μέσω των κυτταρικών προεξοχών που είναι γνωστά ως ποδοσώματα. Τα ποδοσώματα και τα invadopodia (γνωστά με τον όρο invadosomes) είναι δομές πλούσιες σε ακτίνη με πρωτεολυτική δραστηριότητα, που οδηγεί στην αποικοδόμηση της ECM. Η SH3PXD2A (γνωστή ωςTKS5) είναι μια πρωτεΐνη που εντοπίζεται και απαιτείται για το σχηματισμό των invadosomes. Μέχρι στιγμής, η Tks5 έχει βρεθεί να σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με τον καρκίνο, συμμετέχοντας στην κυτταρική εισβολή των καρκινικών κυττάρων. Είναι γνωστό ότι οι πνευμονικοί ινοβλάστες (ΠΙ) παρουσιάζουν κοινά χαρακτηριστικά με τα καρκινικά κύτταρα, ένα από αυτά είναι η εισβολή στην ECM. Έτσι, το TKS5 και τα ποδοσώματα μπορεί να εμπλέκονται στην παθογένεια της ΙΠΙ και, ως εκ τούτου, εξετάσαμε περαιτέρω τον ρόλο τους.Αυξημένη έκφραση του TKS5 ανιχνεύθηκε στον πνευμονικό ιστό ασθενών με ΙΠΙ και ποντικών με επαγόμενη από μπλεομυκίνη (BLM) πνευμονική ίνωση, που συσχετίζεται με την αυξημένη έκφραση της αλυσίδας κολλαγόνου τύπου Ι άλφα 1 (COL1A1). Διαπιστώθηκε ότι το προϊνωτικό περιβάλλον ο TGFβ, καθώς και η ινωτική ECM, επάγουν την έκφραση του TKS5 και τον σχηματισμό ροζετών ποδοσωμάτων στους ΠΙ, που οδηγεί στην αυξημένη εισβολή στην ECM. Τα ποδοσώματα διατηρήθηκαν ex vivo απουσία οποιασδήποτε διέγερσης, υποδεικνύοντας ότι ο σχηματισμός ποδοσωμάτων με τη βοήθεια του TKS5 αποτελεί εγγενή ιδιότητα των ΠΙ της ΙΠΙ. Tα Tks5+/- ποντίκια παρουσιάζονται ανθεκτικά στην επαγόμενη από BLM πνευμονική ίνωση. Η προστασία από τη νόσο οφειλόταν σε μεγάλο βαθμό στον μειωμένο σχηματισμό ποδοσωμάτων στους ΠΙ και στη μειωμένη εισβολή της ECM, υποδεικνύοντας έτσι την ενεργοποίηση του TKS5 και τη διαμεσολαβούμενη από τα ποδοσώματα εισβολή της ECM ως κύριο παθογενετικό μηχανισμό στην πνευμονική ίνωση. Η ανάλυση προφίλ έκφρασης αποκάλυψε μια διασταυρούμενη σύνδεση ECM-ποδοσωμάτων και η φαρμακολογική ανάλυση χάρτη συνδεσιμότητας πρότεινε διάφορους αναστολείς που θα μπορούσαν να αποτρέψουν τον σχηματισμό ποδοσωμάτων και, συνεπώς, την πνευμονική ίνωση. Μεταξύ αυτών, η αναστολή της κινάσης Src φάνηκε να μετριάζει ισχυρά τον σχηματισμό ποδοσωμάτων σε ΠΙ, την εισβολή στην ECM, καθώς και την πνευμονική ίνωση σε τομές πνευμόνων κομμένες με ακρίβεια, μετά την χορήγηση BLM, γεγονός που υποδηλώνει ότι η φαρμακολογική στόχευση του σχηματισμού ποδοσωμάτων μέσω του TKS5 είναι μια πολύ υποσχόμενη θεραπευτική επιλογή στην πνευμονική ίνωση. Επιπρόσθετα στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε ο ρόλος του Versican (Vcan) στην παθογένεια της ΙΠΙ. Η Versican είναι μια μεγάλη πρωτεογλυκάνη της εξωκυττάριας μήτρας (ECM) που εντοπίζεται σε διάφορους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα. H εξωκυττάρια μήτρα είναι μια δυναμική δομή, που αποτελείται από περισσότερες από 300 πρωτεΐνες, γλυκοζαμινογλυκάνες και ένζυμα, και χρησιμεύει ως δομικό ικρίωμα συμβάλλοντας στη μηχανική σταθερότητα που απαιτείται για τη σωστή λειτουργία των πνευμόνων. Η απορρύθμιση της σύνθεσης, της δομής, της ακαμψίας και της αφθονίας της ECM συμβάλλει σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένης της ΙΠΙ. Λόγω των πολυάριθμων ενδείξεων ότι η ECM εμπλέκεται στην παθογένεια της ΙΠΙ, η Versican, ως συστατικό της ECM, θα μπορούσε να εμπλέκεται και ως εκ τούτου επιδιώξαμε την περαιτέρω μελέτη του. In silico μελέτες, σε σύνολα δεδομένων ανθρώπων και ποντικών, αποκαλύπτουν αυξημένη έκφραση του VCAN σε ασθενείς με ΙΠΙ και σε πνεύμονες ποντικών με επαγόμενη από μπλεομυκίνη πνευμονική ίνωση. Στους πνεύμονες ασθενών το VCAN εκφράζεται κυρίως από ινοβλάστες, μακροφάγα και δενδριτικά κύτταρα, όπου οι ΠΙ που εκφράζουν VCAN βρέθηκε ότι ανήκουν στον υποπληθυσμό που εκφράζει COL1A1. In vitro βρέθηκε ότι ο TGFβ διεγείρει την έκφραση του VCAN σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης σε πνευμονικούς ινοβλάστες που προέρχονται από ανθρώπους και ποντικούς. Επιπλέον, η δύσκαμπτη ινωτική aECM επάγει την έκφραση του Vcan στους ινοβλάστες. Σε in vivo πειράματα, αυξημένη έκφραση του Vcan βρέθηκε σε ποντίκια αγρίου τύπου με επαγόμενη από μπλεομυκίνη πνευμονική ίνωση. Η ανοσοϊστοχημεία αποκάλυψε αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης Vcan στο βρογχικό επιθήλιο, στις ινωτικές περιοχές και στα μακροφάγα. Για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της Vcan στην ΙΠΙ, το μοντέλο της επαγόμενης από BLM πνευμονικής ίνωσης πραγματοποιήθηκε σε ποντίκια Vcan+/-. Η ετερόζυγη γενετική διαγραφή του Vcan οδηγεί σε επιδεινούμενο φαινότυπο πνευμονικής ίνωσης σε ποντίκια. Επίσης, η απομόνωση Vcan+/- πρωτογενών ΠΙ αποκάλυψε διαφορές σε βασικές κυτταρικές λειτουργίες, ενώ η διέγερση με TGFβ, επηρεάζει την mRNA έκφραση ινωτικών γονιδίων και επάγει το σχηματισμό ροζετών ποδοσωμάτων, οδηγώντας σε αυξημένη εισβολή. Συμπερασματικά, η επιδείνωση της νόσου στα ποντίκια Vcan+/- συσχετίζεται με τη διαταραχή της ομοιόστασης της ECM, τη διαφοροποίηση των αποκρίσεων του TGFβ, την αυξημένη προσκόλληση των ινοβλαστών και το σχηματισμό ποδοσωμάτων που οδηγούν σε αυξημένη μετανάστευση και εισβολή στην ECM.