Πρωτεολυτική δραστηριότητα στον εξωκυττάριο χώρο στη λοίμωξη από H. pylori: μελέτη της συμβολής σηματοδοτικών μονοπατιών MAPK στην έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών θεμέλιας ουσίας MMP-3 και MMP-9

Abstract

Persistent Helicobacter pylori infection (H. pylori) induces chronic active gastritis and is the main risk factor for the development of gastric adenocarcinoma. Deregulation of the epithelium during infection entails increased proteolytic actvity mediated by matrix metalloproteinases (MMPs). MMPs, originating from epithelial and stromal cells, degrade extracellular matrix components, thus promoting inflammation and tissue transformation. Previous observations from our lab showcased induction of Stromelysin-1 (MMP-3) and Gelatinase B (MMP-9) following in vitro H. pylori infection, with relation to intracellular activity of bacterial oncoprotein CagA. CagA, a major H. pylori virulence factor, is injected via the Type 4 Secretion System (T4SS) into the cytoplasm, where it interacts with host kinases thus deregulating signaling pathways involved in proliferation, apoptosis, cell polarity, adhesion and cellular motility. This project aimed to assess the involvement of CagA in the expression of MMP-3 and MMP-9 murine gastric tissue during in vivo experimental H. pylori infection and studied the contribution of MAPK signaling in the expression of MMP-3 and MMP-9 during experimental H. pylori infection of gastric epithelial cells. With regards to the first objective, C57BL/6 mice were infected with H. pylori strains HPARE (CagA-positive: n=20 mice), HPARE ΔCagA (n=20 mice) and SS1 (CagA-positive, non functional T4SS: n=20 mice), while equal number of animal (n=20) were left uninfected throughout the experimental duration. Gastric tissue samples (n=10 per study group) were collected at 6 and 9 months post infection. Mmp-3 and Mmp-9 transcriptional expression was evaluated via quantitative RT-qPCR while corresponding protein levels were immunohistochemically determined. Successful H. pylori infection was verified by measurement of anti-H. pylori serum IgG at 2, 6 and 9 months via in house-ELISA. All study group animals displayed established H. pylori infection while CagA-positive, T4SS-functional HPARE strain induced detectable IgG antibodies, as early as 2 months. Highest IgG levels were detected 9 months post infection, wherupon all study grous displayed anti-H. pylori antibodies. In order to assess T4SS functionality during infection, the capacity to induce IL-8 secretion in epithelial cells supernatants was assessed following co-culture with the isolated strain at 9 months vs the initial HPARE strain. Clonality between the two strains was confirmed via RAPD PCR. Transcriptional upregulation of Mmp-3 and Mmp-9 was observed at 9 months, in both study groups infected with CagA-positive H. pylori strains, irrespective of T4SS functionality. Following immunohistochemical analysis increased MMP-3 and MMP-9 protein levels were demonstrated at 6 months, especially in the CagA-positive HPARE strain infected study group. At 9 months, all study groups displayed comparable expression levels of both MMPs. Classification and grading of gastritis in mice according to the updated Sydney system demonstrated the induction of chronic active gastritis with moderate to marked lymphocytic infiltration and mild to moderate neutrophilic infiltration in the lamina propria. To assess the contribution of MAPK signalling pathways in MMP-3 and MMP-9 expression, we utilized human gastric epithelial adenocarcinoma cell line AGS and the embryonal gastric epithelial cell line GES-1 immortalized by SV40 transformation. Both cell lines were infected for 24 ours with H. pylori strain P12 (CagA-positive), in the presence of chemical inhibitors targeting JNK (Sp600125), ERK1/2 (PD98059) and p38 (SB203580) pathways and the transcriptional and protein expression of MMP-3 and MMP-9 were determined via qPCR and Western blot, respectively. Inhibitors specific for JNK and ERK1/2 led to downregulation of c-Jun and ERK1/2 kinase activation in the presence of H. pylori infection, while p38 inhibition led to accumulation of its phosphorylated isoform (pp38). Inhibition of ERK1/2 resulted in MMP-3 and MMP-9 mRNA and protein downregulation in both cell lines. Likewise, protein expression levels of both MMPs were found attenuated under JNK inhibition in both cell lines. However, transcription levels of both MMPs within this model were downregulated only in GES-1 cells, owing to the fact that ERK1/2 signaling in AGS cells is intrinsically activated due to a G12D mutation in KRAS. Similar activation of ERK1/2 kinases in the presence of p38 inhibitor was detected in both cell lines, implying a crosstalk between MAPKs. The work in this thesis underscores the upregulation of MMP-3 and MMP-9 during in vivo H. pylori infection concomitantly with the induction of chronic active gastritis displaying moderate to marked lymphocyte infiltration and mild to moderate neutrophil infiltration. The roles of CagA and T4SS are exemplified in MMPs upregulation, especially during early infection. Furthermore, this project highlights ERK1/2 and JNK as primary mediators of MMP-3 and MMP-9 expression during H. pylori infection, as well as crosstalk between MAPK signaling pathways, serving as putative therapeutic targets for preventing gastric neoplasia.

Η εμμένουσα λοίμωξη από το Helicobacter pylori (H. pylori) προκαλεί χρόνια ενεργό γαστρίτιδα ενώ αποτελεί προεξάρχων παράγοντα κινδύνου ανάπτυξης γαστρικού αδενοκαρκινώματος. Η αποδιοργάνωση του επιθηλίου στο πλαίσιο της λοίμωξης περιλαμβάνει αυξημένη πρωτεολυτική δραστηριότητα, διαμεσολαβούμενη και από μεταλλοπρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (MMPs). Οι MMPs, προερχόμενες από το επιθήλιο και τα κύτταρα του στρώματος, αποδομούν συστατικά του εξωκυττάριου χώρου, προωθώντας έτσι τη φλεγμονή και την ιστική εξαλλαγή. Προηγούμενα αποτελέσματα του εργαστηρίου ανέδειξαν την επαγωγή έκφρασης της Στρωμελυσίνης-1 (MMP-3) και της Ζελατινάσης Β (MMP-9) μετά από in vitro H. pylori λοίμωξη, σε συνάρτηση με την ενδοκυτταρική δράση της βακτηριακής ογκοπρωτεΐνης CagA. Η CagA, βασικός λοιμοτοξικός παράγοντας του H. pylori, ενίεται μέσω του εκκριτικού συστήματος τύπου 4 (T4SS) στο κυτταρόπλασμα, όπου αλληλεπιδρά με κινάσες του ξενιστή, απορρυθμίζοντας έτσι οδούς μεταγωγής σήματος που εμπλέκονται μεταξύ άλλων στον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, την κατάργηση της κυτταρικής πολικότητας, την κατάλυση των διακυτταρικών συνδέσμων και την κυτταρική κινητικότητα. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν αφενός, η μελέτη της επίπτωσης της δράσης της CagA στην έκφραση των MMP-3 και MMP-9 γαστρικού ιστού, στο πλαίσιο πειραματικής in vivo H. pylori λοίμωξης, αφετέρου δε, η μελέτη της συμβολής των οδών μεταγωγής σήματος των MAPKs στην έκφραση των εν λόγω MMPs σε πειραματικά συστήματα in vitro H. pylori λοίμωξης γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων. Αναφορικά με το πρώτο σκέλος της μελέτης, C57BL/6 ποντικοί μολύνθηκαν με τα H. pylori στελέχη HPARE (CagA-θετικό: n ποντικών = 20), HPARE ΔCagA (n ποντικών = 20) και SS1 (CagA-θετικό, μη-λειτουργικό T4SS: n ποντικών = 20). Έξι (6) και 9 μήνες μετά την πρωτολοίμωξη συλλέχθηκαν γαστρικοί ιστοί από 10 ποντικούς ανά ομάδα μελέτης και χρονική στιγμή αντίστοιχα. Η μεταγραφική έκφραση των Mmp-3 και Mmp-9 μελετήθηκε με ποσοτική RT-PCR ενώ τα αντίστοιχα επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν ανοσοϊστοχημικά. Για την επιβεβαίωση της επιτυχούς H. pylori λοίμωξης έγινε ανίχνευση IgG αντισωμάτων ορού έναντι του βακτηρίου στους 2, 6 και 9 μήνες, μέσω in house-ELISA. Το σύνολο των ζώων στις ομάδες μελέτης κατέδειξε εγκαταστημένη H. pylori λοίμωξη, με το HPARE CagA-θετικό, με λειτουργικό T4SS στέλεχος να επάγει ανιχνεύσιμα αντισώματα ήδη από τους πρώτους 2 μήνες. Η μέγιστη θετικοποίηση καταγράφηκε 9 μήνες μετά τη λοίμωξη, όπου σε όλες τις ομάδες μελέτης παρατηρήθηκαν αντισώματα έναντι του H. pylori. Η λειτουργικότητα του T4SS κατά τη διάρκεια της λοίμωξης, επιβεβαιώθηκε με προσδιορισμό της έκκρισης IL-8 στο υπερκείμενο επιθηλιακών κυττάρων μετά από συγκαλλιέργεια με το απομονωθέν στους 9 μήνες στέλεχος έναντι του αρχικά χορηγηθέντος HPARE στελέχους. Η κλωνική σχέση μεταξύ των δύο στελεχών επιβεβαιώθηκε μέσω RAPD PCR. Αναφορικά με την έκφραση των MMPs στο γαστρικό ιστό, παρατηρήθηκε μεταγραφική αυξορρύθμιση των Mmp-3 και Mmp-9 στους 9 μήνες, στις δύο ομάδες μελέτης με τα H. pylori CagA-θετικά στελέχη, ανεξάρτητα της λειτουργικότητας του T4SS. Ανοσοϊστοχημικά, παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα MMP-3 και MMP-9 στους 6 μήνες, ειδικά στην ομάδα λοίμωξης με το CagA-θετικό στέλεχος HPARE. Στους 9 μήνες όλες οι ομάδες μελέτης εμφάνισαν συγκρίσιμα επίπεδα έκφρασης και των δύο MMPs. Η ιστοπαθολογική αξιολόγηση ανέδειξε την ανάπτυξη χρόνιας ενεργού γαστρίτιδας με μέτρια έως έντονη βαρύτητα και ήπιας έως μέτριας δραστηριότητα, σύμφωνα με το αναθεωρημένο σύστημα αξιολόγησης της γαστρίτιδας κατά Sydney.Ακολούθως αξιολογήθηκε η συμβολή των οδών μεταγωγής σήματος των MAPKs στην έκφραση των MMP-3 και MMP-9 και για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινης προέλευσης επιθηλιακά κύτταρα γαστρικού αδενοκαρκινώματος (AGS) καθώς και εμβρυϊκά γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα αθανατοποιημένα μέσω SV40 λοίμωξης (GES-1). Αμφότερες κυτταρικές σειρές μολύνθηκαν για 24 ώρες με το H. pylori στέλεχος P12 (CagA-θετικό) παρουσία χημικών αναστολέων των οδών μεταγωγής σήματος JNK (SP600125), ERK1/2 (PD98059) και p38 (SB203580) και προσδιορίστηκε η μεταγραφική και πρωτεϊνική έκφραση των MMP-3 και MMP-9 με ποσοτική RT-PCR και Western blot, αντίστοιχα. Επιβεβαιώθηκε ότι οι ειδικοί αναστολείς των JNK και ERK1/2 οδήγησαν σε μειορρύθμιση της ενεργοποίησης των αντίστοιχων κινασών c-Jun και ERK1/2 στο υπόβαθρο της H. pylori λοίμωξης, ενώ αναστολή του p38 οδήγησε στη συσσώρευση της φωσφορυλιωμένης ισομορφής της κινάσης (pp38). Αναστολή των ERK1/2 είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση των επιπέδων mRNA και πρωτεΐνης των MMP-3 και MMP-9 και στις δύο κυτταρικές σειρές. Ομοίως, τα επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης των δύο MMPs εμφανίστηκαν μειωμένα, παρουσία αναστολέα του JNK και στις δύο κυτταρικές σειρές. Αξιοσημείωτο είναι ότι τα μεταγραφικά επίπεδα των δύο MMPs στο σύστημα αυτό μειορρυθμίστηκαν μόνο στην περίπτωση των GES-1 κυττάρων, καθώς η σηματοδοτική οδός ERK1/2 στα AGS κύτταρα είναι ενδογενώς ενεργοποιημένη λόγω παρουσίας της G12D KRAS μετάλλαξης. Παρόμοια ενεργοποίηση των ERK1/2 κινασών παρουσία του αναστολέα του p38 ανιχνεύθηκε και στις δύο κυτταρικές σειρές, υποδηλώνοντας διασταυρούμενη απόκριση μεταξύ των MAPKs. Στην παρούσα διατριβή αναδεικνύεται η υπερέκφραση των MMP-3 και MMP-9 κατά την in vivo H. pylori λοίμωξη με συνοδό ανάπτυξη γαστρίτιδας στο χόριο με μέτρια έως έντονη λεμφοκυτταρική παρουσία και ήπια έως μέτρια ουδετεροφιλική διήθηση. Αναδεικνύεται επίσης, ο ρόλος της CagA και του T4SS στην εν λόγω υπερέκφραση, ειδικά κατά τα αρχικά στάδια της λοίμωξης. Επιπλέον, υπογραμμίζεται ο κομβικός ρόλος των ERK1/2 και δευτερευόντως της JNK στην έκφραση των MMP-3 και MMP-9, καθώς και η διασταυρούμενη επικοινωνία μεταξύ των οδών μεταγωγής σήματος MAPKs, ως πιθανών θεραπευτικών στόχων για την πρόληψη της γαστρικής νεοπλασίας.