Chemical and epigenetic regulation of macrophage activation and metabolism

Abstract

Inflammation is the first barrier against external and internal stimuli. It’s a multistep process including several complex mechanisms and driven by a great number of mediators and immune cells. Macrophages are effector cells of the immune system involved both in the initiation and resolution of inflammation that derive from monocyte precursors. They acquire an array of phenotypes broadly characterized as M1 and M2-like phenotypes. M1macrophages express pro-inflammatory cytokines such as TNFa, IL-6 and IL-12 and secrete nitric oxide. On the other hand, M2 macrophages are involved in the resolution of inflammation and wound healing by expressing anti-inflammatory mediators such as Arginase1, MRC1, Fizz1 and Ym1. A broad spectrum of transcriptional regulatory programs such as the NF-kB and the MAPK/AKT signaling cascades ensure a well-coordinated inflammatory response. Tight coordination of the inflammatory response is pivotal for maintaining homeostasis as inflammatory dysregulation potentially results in the initiation of inflammation-related diseases such as autoimmunity, atherosclerosis and cancer.In the first part of this study, we screened for new chemical compounds with antiinflammatory properties deriving from the marine algae Laurencia glandulifera and Dictyopteris membranaceae. Having screened several compounds we showed that diterpenes 1-3 exhibited significant anti-inflammatory properties in RAW 264.7 macrophages inducing anti-inflammatory mediators’ production in naïve macrophages whereas reduced theproduction of pro-inflammatory cytokines in LPS activated macrophages. Diterpenes 1 and 3 exhibited the most potent anti-inflammatory properties with IC50 of 2.32μM and 2.92μM, respectively. Interestingly, diterpenes 2 and 3 managed to alleviate intestinal inflammation in a model of DSS induced colitis, reducing pro-inflammatory cytokine production and maintaining intestinal tissue integrity. Moreover, we showed that disulfides 4-6 deriving from D. membranaceae suppress macrophage activation in response to LPS stimulation by reducing pro-inflammatory cytokine production and this is mediated through the MAPK/AKT pathway exhibiting elevated AKT phosphorylation and diminished ERK1/2 phosphorylation. Then, we aimed to investigate the potential use of total dried algae Laurencia and Dictyopteris as dietary supplements and their potential role in alleviating inflammation related diseases. Indeed, we showed that diet supplementation with Laurencia or Dictyopteris reduced insulin resistance in high-fat induced obese mice and modulated theintestinal microbiome. Specifically, it not only maintained colonization of rare microbial taxa but also induced colonisation of beneficial bacteria in a sex-dependent manner. Using also a DSS-induced colitis model we showed that diet supplementation with Dictyopterisameliorated the colitis phenotype in mice by reducing colon length shortening and proinflammatory cytokine and chemokine secretion.Although there is plenty of information on macrophage activation and polarization, little is known about the epigenetic regulation of the same processes. In the second part of the present study, we focus on investigating the role of histone demethylases PHF2 and PHF8 in macrophage activation and metabolism. First, we showed that PHF2 and PHF8 are differentially expressed upon TLR4-mediated activation indicating differential roles in macrophage activation. PHF2 expressed early (2h) upon LPS stimulation, whereas PHF8 expressed late (12h) following LPS stimulation, indicating a potential role in endotoxin tolerance. Then, we generated stable overexpressing and knock-out RAW 264.7 macrophages using a CRISPR-Cas9 lenti-viral system and studied their activation profile in response to LPS stimulation. We showed that PHF2 positively regulated pro-inflammatorygene production by actively binding on inflammatory gene promoters as well as it was necessary for the phagocytic capacity macrophages. On the contrary, PHF8 is a negative regulator of macrophage activation reducing pro-inflammatory gene expression in the context of endotoxin tolerance by actively binding on inflammatory gene promoters and positively regulates the phagocytic capacity of macrophages. In addition, PHF8 is a majorregulator of metabolism during macrophage activation reducing major glycolytic genes and negatively regulating mitochondrial biogenesis and function. Specifically, PHF8 over expressing macrophages possess reduced mitochondrial mass and impaired mitochondrial function, exhibiting reduced ATP production and basal respiration capacity.Overall, this study adds to the current knowledge on macrophage activation and metabolism and proposes new chemical compounds as anti-inflammatory drugs with potential pharmaceutical interest in inflammatory responses. Moreover, it shades light into the field of the epigenetic regulation of innate immunity unravelling the major functions of histone demethylases PHF2 and PHF8 in macrophage activation and metabolism.

Η φλεγμονή είναι μέρος της πρώτης γραμμής άμυνας του οργανισμού ενάντια σε εξωτερικά και εσωτερικά παθολογικά ερεθίσματα. Είναι μια διαδικασία πολλαπλών σταδίων με αρκετούς και πολύπλοκους μηχανισμούς που περιλαμβάνει ένα μεγάλο αριθμό μεσολαβητών και κυττάρων του ανοσοποιητικού. Τα μακροφάγα είναι επαγγελματικά φαγοκύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος που εμπλέκονται τόσο στην έναρξη όσο και στην επίλυση της φλεγμονής και προέρχονται από πρόδρομες μορφές μονοκυττάρων του μυελού των οστών. Αποκτούν μια σειρά φαινοτύπων που χαρακτηρίζονται ευρέως ως φαινότυποι τύπου Μ1 και Μ2. Τα μακροφάγα Μ1 εκφράζουν προφλεγμονώδεις κυτοκίνες όπως TNFa, IL-6 και IL-12 και εκκρίνουν μονοξείδιο του αζώτου. Ενώ, τα μακροφάγα Μ2 εμπλέκονται στην επίλυση της φλεγμονής και στην επούλωση του τραύματος εκφράζοντας αντιφλεγμονώδεις μεσολαβητές όπως η Arginase1, MRC1, Fizz1 και Ym1. Ένα ευρύ φάσμα μεταγραφικών μονοπατιών όπως το NF-kB και οι καταρράκτες σηματοδότησης MAPK/AKT εξασφαλίζουν μια καλά συντονισμένη φλεγμονώδη απόκριση. Ο απόλυτα συντονισμένος μηχανισμός της φλεγμονής είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση της ομοιόστασης καθώς μια πιθανή απορρύθμιση δυνητικά έχει ως αποτέλεσμα την έναρξη φλεγμονωδών ασθενειών όπως οι αυτοανοσίες, η αθηροσκλήρωση και ο καρκίνος.Στο πρώτο μέρος αυτής της μελέτης, ψάξαμε για νέες χημικές ενώσεις με αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες που προέρχονται από τα θαλάσσια φύκη Laurencia glandulifera και Dictyopteris membranaceae. Έχοντας εξετάσει αρκετές ενώσεις, δείξαμε ότι τα διτερπένια 1-3 εμφάνισαν σημαντικές αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες χρησιμοποιώντας μακροφάγα RAW 264.7. Τα διτερπένια αυτά προκάλεσαν την παραγωγή αντιφλεγμονωδών μεσολαβητών στην κυτταρική σειρά RAW 264.7 ενώ μείωσαν την παραγωγή προφλεγμονοδών κυτοκινών σε μακροφάγα κύτταρα που ενεργοποιήθηκαν με LPS. Τα διτερπένια 1 και 3 παρουσίασαν τις πιο ισχυρές αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες με IC50 2,32μM και 2,92μM, αντίστοιχα. Είναι ενδιαφέρον ότι τα διτερπένια 2 και 3 κατάφεραν να μειώσουν την εντερική φλεγμονή σε μοντέλο κολίτιδας που προκαλείται από DSS, μειώνοντας την παραγωγή προφλεγμονοδών κυτοκινών και διατήρησαν την ακεραιότητα του εντερικού ιστού παρά την χρήση του DSS. Επιπλέον, δείξαμε ότι τα δισουλφίδια 4-6 που προέρχονται από το D. membranaceae καταστέλλουν την ενεργοποίηση των μακροφάγων ως απόκριση στη διέγερση με LPS μειώνοντας την παραγωγή προφλεγμονοδών κυτοκινών και αυτό πραγματοποιείται μέσω των MAPK/AKT μονοπατιών. Συγκεκριμένα, είδαμε αυξημένη φοσφωρυλίωση της AKT κινάσης ενώ μειωμένη φοσφωρυλίωση των ERK1/2. Στη συνέχεια, θέλαμε να διερευνήσουμε την πιθανή χρήση των ολικών αποξηραμένων φυκών Laurencia και Dictyopteris ως συμπληρώματα διατροφής και τον πιθανό ρόλο τους κατά την επαγωγή φλεγμονωδών ασθενειών. Πράγματι, δείξαμε ότι η χρήση τους ως συμπληρώματα διατροφής μείωσε την αντίσταση στην ινσουλίνη σε παχύσαρκα ποντίκια και ρύθμισε τη σύσταση του εντερικού μικροβιώματος. Συγκεκριμένα, όχι μόνο διατήρησε τον αποικισμό των σπάνιων ταξινομικά μικροβίων, αλλά προκάλεσε επίσης αποικισμό ωφέλιμων βακτηρίων με τρόπο που εξαρτάται από το φύλο των ποντικών. Χρησιμοποιώντας επίσης ένα μοντέλο κολίτιδας σε ποντίκια που προκαλείται από DSS, δείξαμε ότι η συμπλήρωση διατροφής με Dictyopteris βελτίωσε την εντερική φλεγμονή, μειώνοντας τη βράχυνση του μήκους του παχέος εντέρου και μειώνοντας την έκκριση προφλεγμονοδών κυτοκινών.Αν και υπάρχουν πολλές πληροφορίες σχετικά με τη μεταγραφική ρύθμιση της ενεργοποίησης και της πόλωσης των μακροφάγων, λίγα είναι γνωστά για την επιγενετική ρύθμιση των ίδιων διεργασιών. Στο δεύτερο μέρος της παρούσας μελέτης, εστιάσαμε στη διερεύνηση του ρόλου των απομεθυλασών των ιστονών PHF2 και PHF8 στην ενεργοποίηση και τον μεταβολισμό των μακροφάγων. Πρώτα δείξαμε ότι οι πρωτεΐνες PHF2 και PHF8 εκφράζονται σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα κατά την ενεργοποίηση με LPS, υποδεικνύοντας διαφοροποιημένους ρόλους στην ενεργοποίησητων μακροφάγων. Η PHF2 εκφράζεται νωρίς (2 ώρες) κατά τη διέγερση με LPS, ενώ η PHF8 εκφράζεται αργά (12 ώρες) κατά τη διέγερση LPS, υποδεικνύοντας έναν πιθανό ρόλο στην ανοχή μέσω ενδοτοξίνης. Στη συνέχεια, δημιουργήσαμε σταθερές κυτταρικές σειρές μακροφάγων κυττάρων RAW 264.7 που υπερέκφραζαν ή είχαν έλλειψη στην PHF8 ή την PHF2 χρησιμοποιώντας το σύστημα CRISPR-Cas9 μέσω λέντι-ιικών φορέων και μελετήσαμε το προφίλ ενεργοποίησής τους ως απόκριση στη διέγερση με LPS. Δείξαμε ότι η PHF2 ρυθμίζει θετικά την έκφραση προφλεγμονοδώνγονιδίων όντας δεσμευμένη στους υποκινητές αυτούς, καθώς επίσης είναι και απαραίτητη για τη φαγοκυτταρική ικανότητα των μακροφάγων κυττάρων. Αντίθετα, η PHF8 είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της ενεργοποίησης των μακροφάγων μειώνοντας την έκφραση προφλεγμονοδών γονιδίων στο πλαίσιο της ανοχής στην ενδοτοξίνη, όντας δεσμευμένη ενεργά σε υποκινητές φλεγμονωδών γονιδίων και ρυθμίζοντας θετικά τη φαγοκυτταρική ικανότητα των μακροφάγων. Επιπλέον, η PHF8 είναι ένας κύριος ρυθμιστής του μεταβολισμού κατά την ενεργοποίηση των μακροφάγων μειώνοντας βασικά γλυκολυτικά γονίδια και ρυθμίζοντας αρνητικά τη βιογένεση και τη λειτουργία των μιτοχονδρίων. Συγκεκριμένα, τα μακροφάγα που υπερεκφράζουν PHF8 έχουν μειωμένη μιτοχονδριακή μάζα και εξασθενημένη μιτοχονδριακή λειτουργία, παρουσιάζοντας μειωμένη παραγωγή ΑΤΡ και ικανότητα βασικής αναπνοής.Συνολικά, αυτή η μελέτη συμβάλει στην τρέχουσα γνώση για την ενεργοποίηση και το μεταβολισμό των μακροφάγων κυττάρων και προτείνει νέες χημικές ενώσεις ως αντιφλεγμονώδη φάρμακα με πιθανό φαρμακευτικό ενδιαφέρον και χρήση σε φλεγμονώδεις νόσους. Επιπλέον, δίνει φως στο πεδίο της επιγενετικής ρύθμισης της έμφυτης ανοσίας αποκαλύπτοντας τις κύριες λειτουργίες των απομεθυλασών ιστόνης PHF2 και PHF8 στην ενεργοποίηση και το μεταβολισμό των μακροφάγων κυττάρων.