Περίληψη
Με σκοπό τον προσδιορισμό μετάλλων στο επίπεδο διακριτών σωματιδίων και κυττάρων, αυτή η διατριβή πραγματεύεται την ανάπτυξη προχωρημένων μεθόδων βασισμένων στη φασματομετρία μάζας επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (ICP-MS). Λόγω των φανερών πλεονεκτημάτων των διατάξεων μικρορευστονικής (microfluidics) στο χειρισμό βιολογικών δειγμάτων περιορισμένου όγκου, όπως τα δείγματα κυττάρων/σωματιδίων, δίδεται έμφαση στη σύζευξη διατάξεων microfluidics με ICP-MS. Δομικά, αυτή η διατριβή αποτελείται από 5 μελέτες.Η πρώτη μελέτη αφορά την ανάπτυξη κι εφαρμογή της τεχνικής single-cell (SC)-ICP-MS για τον προσδιορισμό της πρόσληψης αρσενικικών από διακριτά κύτταρα C. reinhardtii, ανεπτυγμένα σε 12.5, 22.5 και 30 μg As/mL. Συγκριτικά με τις συμβατικές αναλυτικές μεθόδους, προσδιορίστηκε η κατανομή του αρσενικού (As) στον κυτταρικό πληθυσμό μέσω του SC-ICP-MS. Τα κύτταρα C. reinhardtii επέδειξαν ετερογενή πρόσληψη As, όπως υπέδειξαν τα ιστογράμματα μάζας στα οποία προσαρμόστηκε κατανομή lognormal. Η πι ...
Με σκοπό τον προσδιορισμό μετάλλων στο επίπεδο διακριτών σωματιδίων και κυττάρων, αυτή η διατριβή πραγματεύεται την ανάπτυξη προχωρημένων μεθόδων βασισμένων στη φασματομετρία μάζας επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (ICP-MS). Λόγω των φανερών πλεονεκτημάτων των διατάξεων μικρορευστονικής (microfluidics) στο χειρισμό βιολογικών δειγμάτων περιορισμένου όγκου, όπως τα δείγματα κυττάρων/σωματιδίων, δίδεται έμφαση στη σύζευξη διατάξεων microfluidics με ICP-MS. Δομικά, αυτή η διατριβή αποτελείται από 5 μελέτες.Η πρώτη μελέτη αφορά την ανάπτυξη κι εφαρμογή της τεχνικής single-cell (SC)-ICP-MS για τον προσδιορισμό της πρόσληψης αρσενικικών από διακριτά κύτταρα C. reinhardtii, ανεπτυγμένα σε 12.5, 22.5 και 30 μg As/mL. Συγκριτικά με τις συμβατικές αναλυτικές μεθόδους, προσδιορίστηκε η κατανομή του αρσενικού (As) στον κυτταρικό πληθυσμό μέσω του SC-ICP-MS. Τα κύτταρα C. reinhardtii επέδειξαν ετερογενή πρόσληψη As, όπως υπέδειξαν τα ιστογράμματα μάζας στα οποία προσαρμόστηκε κατανομή lognormal. Η πιο συχνά εμφανιζόμενη μάζα As παρέμεινε σχετικά σταθερή, μεταξύ 1.5-1.8 fg/κύτταρο, για όλες τις συγκεντρώσης έκθεσης As, το οποίο πιθανώς υποδεικνύει κορεσμό στην πρόσληψη As από την πλειοψηφία των κυττάρων. Ενώ η μέση lognormal μάζα As κυμαινόμενη μεταξύ 2.7-4.1 fg/κύτταρο υπέδειξε ότι ένα σημαντικό ποσοστό του κυτταρικού πληθυσμού προσέλαβε υψηλότερες ποσότητες αρσενικικών. Σημαντική μάζα κυτταρικού As ήταν προσδεμένη στο κυτταρικό τοίχωμα, όπως έδειξε μία πτώση του 30% στο κυτταρικό αρσενικό των κυττάρων που υπέστησαν πλύσεις. Η δεύτερη μελέτη αναφέρεται στην ανάπτυξη μίας μεθόδου ανάλυσης δεδομένων που μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην ανάλυση νανοσωματιδίων (NPs) μέσω της τεχνικής του sp-ICP-MS με χρόνους καταγραφής μs. Έτσι, η ανεπτυγμένη τεχνική (A) DP-75μs-sp-ICP-MS επικυρώνεται μέσω συγκρίσεων με τη μέθοδο αναφοράς (B) DP-5σ-10ms-Syngistix Nano, αλλά και μέσω πειραμάτων ισοζυγίου μάζας αργύρου (Αg) σε δείγματα θαλάσσιου νερού. Η ανάλυση πρότυπων αιωρημάτων νανοσωματιδίων μεγέθους 60 nm έδειξε εξαιρετική συμφωνία μεταξύ μεθόδων A) και Β) ως προς την ένταση του σήματος NPs (38.8 και 37 counts από A και B, αντίστοιχα) και την απόδοση μεταφοράς (2.3 and 2.1 % από A και B, αντίστοιχα). Η ανάλυση δειγμάτων θαλάσσιου μεσοκόσμου, στα οποία προστέθηκαν νανοσωματίδια Ag 60 nm σε ένα εύρος συγκέντρωσης 50-500 ng/L, επέφερε ανακτήσεις Ag 83 ± 22% and 86 ± 21% μέσω των μεθόδων A and B, αντίστοιχα. Η χρησιμότητα της ανεπτυγμένης DP-μs-sp-ICP-MS αναδείχτηκε σε ένα πείραμα θαλάσσιου μεσοκόσμου, όπου κατέστη εφικτή η παρακολούθηση σωματιδιακών οντοτήτων Ag στα αρχικά στάδια σχηματισμού. Σε μία τρίτη μελέτη, επιτεύχθηκε η σύζευξη μίας διάταξης microfluidic με το ICP-MS με τη χρήση εμπορικά διαθέσιμων εξαρτημάτων, συμπεριλαμβανομένων ενός υψηλής απόδοσης γυάλινο εκνεφωτή και ειδικό θάλαμο ψεκασμού. Για να επιδείξουμε την απόδοση αυτής της σύζευξης, η τεχνική αραίωσης προτύπου (SDA) εφαρμόστηκε για πρώτη φορά σε ένα σύστημα διάταξης microfluidic με ICP-MS (chip-based ICP-MS). Υψηλές ανακτήσεις (97.4-100.1%) και χαμηλές σχετικές τυπικές αποκλίσεις (2.9-4.8%) επιτεύχθηκαν για τα προσδιορισθέντα μέταλλα (Cd, Co, Pb, Cr) σε αρκετές μήτρες δειγμάτων (με προσθήκες γνωστών ποσοτήτων) και πιστοποιημένα υλικά αναφοράς, ενώ 140 μL δείγματος αρκούν για τριπλή ανάλυση SDA ή 40 μL για μονή ανάλυση.Η τέταρτη μελέτη επιδεικνύει για πρώτη φορά την απευθείας σύζευξη ενός υπερηχητικού εκνεφωτή διάταξης microfluidic (chip-μf-Neb) σε ICP-MS. Tο σύστημα επέδειξε αποδοτική εκνέφωση σε χαμηλότατες ροές υγρών έως και 0.5 μL/min, με ελάχιστο νεκρό όγκο, ενώ η ευαίσθητη ανίχνευση μετάλλων αποδείχτηκε από την υψηλή ευαισθησία που ελήφθη ως προς το Ίνδιο (In), 40000 cps/ (μg/L) σε ροή υγρού 10 μL/min. Το σύστημα επέδειξε απόδοση μεταφοράς 46%, όπως αυτή προσδιορίστηκε με νανοσωματίδια Ag. Τέλος, οι δυνατότητες του συστήματος στην ανάλυση διακριτών κυττάρων αποδείχτηκαν με την ανίχνευση Se, As and P σε μεμονωμένα κύτταρα Chlamydomas reinhardtii.Η πέμπτη μελέτη αναφέρεται στην χρήση των inertial microfluidics για τον εμπλουτισμό κυττάρων και την ταξινόμησή τους βάση μεγέθους, πριν από την ανίχνευσή τους με SC-ICP-MS. Διατάξεις microfluidic που φέρουν κανάλια σπιράλ δουλεύτηκαν σε ένα εύρος συνθηκών Reynolds και Dean, ενώ πολλαπλά κανάλια εξόδου επέτρεψαν την συλλογή δειγμάτων εμπλουτισμένων σε κύτταρα και απουσία αυτών. Υψηλός βαθμός συγκέντρωσης κυττάρων επιτεύχθηκε για τα C. reinhardtii, αφού το 80% των εισαχθέντων κυττάρων συλλέχθηκαν από ένα κανάλι εξόδου. Η ανεξάρτητη ταξινόμηση κυττάρων BMDMS (μέσης διαμέτρου 12 μm) και C. reinhardtii (μέσης διαμέτρου 7 μm) σε συνθήκες De 69.9 υπέδειξε ότι οι 2 κυτταρικές σειρές θα μπορούσαν να συλλεχθούν με 100% και 70 % καθαρότητα, αντίστοιχα, αν βρίσκονταν σε μεικτό κυτταρικό αιώρημα. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε προσδίδει στην τεχνική SC-ICP-MS χαρακτηριστικά κυτταρομετρίας ροής.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
In response to the need for performing metal determination at the level of single particles and single cells, this dissertation reports on the development of advanced methods based on inductively-coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). Due to the evident advantages of microfluidics in manipulating volume-limited biological samples, including single cells/particles, emphasis is given on pairing microfluidic chips to ICP-MS. Structurally, this dissertation is comprised of 5 studies.The first study concerns the development and application of single-cell (SC)-ICP-MS application to determine the uptake of arsenate by individual C. reinhardtii cells, exposed to 12.5, 22.5 and 30 μg As/ mL. Compared to conventional analytical schemes, SC-ICP-MS revealed the distribution of As among single cells. C. reinhardtii demonstrated heterogeneity with respect to As uptake, as evidenced by the broad As mass histograms that were fitted with a lognormal probability function. All exposure concentrations ...
In response to the need for performing metal determination at the level of single particles and single cells, this dissertation reports on the development of advanced methods based on inductively-coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). Due to the evident advantages of microfluidics in manipulating volume-limited biological samples, including single cells/particles, emphasis is given on pairing microfluidic chips to ICP-MS. Structurally, this dissertation is comprised of 5 studies.The first study concerns the development and application of single-cell (SC)-ICP-MS application to determine the uptake of arsenate by individual C. reinhardtii cells, exposed to 12.5, 22.5 and 30 μg As/ mL. Compared to conventional analytical schemes, SC-ICP-MS revealed the distribution of As among single cells. C. reinhardtii demonstrated heterogeneity with respect to As uptake, as evidenced by the broad As mass histograms that were fitted with a lognormal probability function. All exposure concentrations exhibited a similar most frequent As mass of 1.5-1.8 fg/cell, indicating a saturation mass reached by the majority of the cell population, while the lognormal mean As mass of 2.7-4.1 fg/cell indicated that a significant portion of the cell population internalized higher amounts of arsenate. A significant cellular As amount was wall-bound, as evidenced by a 30% drop in the cellular As of washed cells.The second study reports on the development of a data processing method (DP) that can be employed to analyze single nanoparticles (NPs) using single-particle (sp)-ICP-MS by means of μs dwell times. Herein, the developed (A) DP-75μs-sp-ICP-MS is validated through comparisons with the benchmark (B) DP-5σ-10ms-SyngistixTM Nano method, as well as by conducting silver (Ag) mass recovery experiments in seawater samples. Analysis of a reference 60 nm AgNP suspension showed excellent agreement between A and B in terms of NP peak area (38.8 and 37 counts for A and B, respectively) and transport efficiency (2.3 and 2.1 % for A and B, respectively). Analysis of seawater mesocosm tanks, spiked with 60 nm AgNPs, across a concentration range of 50-500 ng/L, yielded Ag mass recoveries of 83 ± 22% and 86 ± 21% for A and B, respectively. The applicability of DP-μs-sp-ICP-MS was demonstrated in a seawater mesocosm experiment, where Ag-containing NPs could be tracked at the early stages of formation.In a third study, coupling of a microfluidic chip to ICP-MS was accomplished using a combination of commercially available components, including a pneumatic high-efficiency nebulizer and a spray chamber designed to allow for the addition of a laminar flow makeup7gas. To demonstrate the efficiency of this coupling, standard dilution analysis (SDA) was employed for the first time for chip-based ICP-MS. High average recoveries (97.4-100.1%) and low average relative standard deviations (2.9-4.8%) were achieved for the determined elements (Cd, Co, Pb, Cr) across several spiked matrices and certified reference materials, whereas only 140 μL of sample is required for SDA in triplicate or 40 μL for a single analysis.The fourth study demonstrates, for the first time, the direct coupling of a chip-based supersonic microfluidic nebulizer (chip-μf-Neb) to ICP-MS. The system exhibited efficient operation at liquid flow rates as low as 0.5 μL/min, with minimum dead volumes, while sensitive metal isotope detection was evidenced by an attained indium (In) sensitivity of 40000 cps (μg/L) at 10 μL/min. The system featured a transport efficiency of 46% for Ag nanoparticles. Finally, the capabilities for conducting single-cell analysis were demonstrated with the detection of 80Se, 75As and 31P16O in single Chlamydomas reinhardtii cells.The fifth study reports on the use of inertial microfluidics for cell focusing and size-based sorting of cell populations prior to SC-ICP-MS detection. Microfluidic chips with spiral channels were operated at a range of Reynolds and Dean numbers, while multiple outlet channels allowed for collection of cell-enriched and cell-free samples. A high degree of cell focusing was achieved for C. reinhardtii, as 80% of the infused cells were collected from a single outlet. Individual sorting of BMDMS cells (diameter of 12 μm) and C. reinhardtii cells (diameter of 7 μm) at a De of 69.9 indicated that the 2 cell lines could be collected with 100% and 70% purity, respectively, when present in the same cell suspension; thus, equipping SC-ICP-MS with flow cytometry capabilities.
περισσότερα