Production of industrial enzymes and bioactive nanoparticles by cyanobacterium Pseudanabaena sp.

Abstract

The current PhD thesis aims at producing biomolecules and high added value products from microorganisms and more specific from cyanobacteria. The used strain is isolated from lake Pamvotis in Greece, that constitute a burdened ecosystem. The produced molecules and products were enzymes, lipids and nanomaterials, that find applications on both industry, energy and medicine domains. The special characteristics of cyanobacterium cells like their ability to grow under a plethora of different habitants, using even wastes, and their ability to produce at the same time different high value products have attached considerable research interest. In this study, a novel cyanobacterium strain, which was isolated from Lake Pamvotis, was studied. After its phylogenetic analysis, it was as Pseudanabaena sp. strain, named Pamv7. Pseudanabaena sp. cells had the ability to grow both in autotrophic and heterotrophic conditions. At the second circumstance, they could grow at a plethora of different substrates, but when at cellobiose, they were producing β-glucosidase. β-glucosidase finds a plethora of application on feed, food, wine, textile, juice industries, and it was not produced before by this type of microorganisms. The current work aimed to this production. So, after the phylogenetic characterization of Pseudanabaena sp. and its biochemical composition, the analytic study of β-glucosidase took place. After the above verification of both enzyme production and its action, the purification of the cultural conditions took place. It constitutes an extremely important step; it is important the achievement of higher production for a scale up. These parameters are substrate concentration, nitrogen source and its concentration and temperature of culture. After the optimizing of them, a scale up of the culture at a bioreactor system of 2L took place. The produced β-glucosidase was purified and its molecular weight was determined, while its kinetic and thermodynamic characteristics were determined. The enzyme had a reduced molecular mass of 66 kDa and activity of about 40U/L, while it was optimally active at 40 oC and pH 6.0 and stable in acidic-neural pHs (6.0-7.0), something that make it applicable to many industrial uses. As Pseudanabaena sp cells were able to produce β-glucosidase, a question was born. Why not and other enzymes, like a-glucosidases? So, using maltose as carbon substrate for the heterotrophic cultivation of Pseudanabaena sp. cells, a-glucosidase was produced with an activity of about 1800 U/L. As a-glucosidase has also great application in industry, the optimization of cell cultural conditions for the greatest enzyme production took place. After that, a scale up of the culture at a bioreactor system of 2L took place, and the produced enzyme was purified and their kinetic and thermodynamic properties were determined. The purified enzyme appeared a reduced molecular mass of 52 kDa, while it was optimally active at 40oC and pH 7.0 and stable in acidic pHs (4.0-6.0), that make it appropriate for applications which demand acidic conditions. Except of enzymes, microalgae and cyanobacteria are known as lipid producers. Moreover, environmental pollution and especially the greenhouse gases, the decrease of fossil fuels in parallel with the population increase, has already lead to search of new and renewable source of energy, like biodiesel. This fact in combination with the fact that cyanobacteria are able to use of wastes as substrates for their growth, can lay the foundation for the adaption of a biorefinery concept, with reduction of environmental footprint, towards the production of biodiesel. So, in this study, Pseudanabaena sp. cells used pretreated hydrolysates from forest biomasses (silver birch and Norway spruce) towards the production of lipids and so as biodiesel. The lipid analysis showed a lipid profile suitable for biodiesel production, while the analysis of the properties of the produced after transesterification biodiesel showed a satisfy quality. Finally, Pseudanabaena sp.cells were used as the factory for the production of extra small silver nanoparticles via a green synthetic process. The aqua cyanobacterial extract acts as reductant and stabilizing agent for Ag+ of AgNO3 to form Ago and AgO nanoparticles. Moreover, its biological compounds act as capping factors for AgNPs creating in such way multiple functionalities. The morphological and structural characteristics of the produced nanoparticles have been characterized using FTIR and XPS spectroscopy, X-ray Diffraction, AFM and TEM microscopy. Further the Ag NPs have been evaluated for their antibacterial action against Gram-negative Escherichia coli and Gram- positive Corynebacterium glutamicum bacterial cells, presented an extremely time and dose dependent lethal effect (15μg/ml of AgNPs (that is 3 μg/ml of Ag+) are able to decrease the cell population about 95%). The silver nanoparticles except of their excellent bactericidal properties, could be also used as an excellent nanosupport for a series of environmental, biological and medical applications. As a conclusion, cyanobacterium cells can act as a bio-factory for a plethora of different bio-molecules and products. This work constitutes the first detailed investigation that concerns the production of enzymes from this type of microorganisms. Moreover, they cells were serving the biorefinery concept, consuming residues and producing sustainable and ecofriendly fuel. Finally, Pseudanabaena sp. cells were used as an alternative platform for the preparation of ultra-small silver nanoparticle, through a low-cost, rapid and eco-friendly synthetic procedure.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στην παραγωγή βιομορίων και υψηλής αξίας προϊόντων από μικροοργανισμούς και πιο συγκεκριμένα από κυανοβακτήρια. Το στέλεχος του κυανοβακτηρίου που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα δουλειά έχει απομονωθεί από το επιβαρυμένο οικοσύστημα της λίμνης Παμβώτιδας. Τα παραγόμενα βιομόρια και προϊόντα είναι ένζυμα, λίπη και νανουλικά, που βρίσκουν εφαρμογές στους τομείς της βιομηχανίας, της ενέργειας και της ιατρικής. Τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά των κυανοβακτηριακών κυττάρων, όπως η ικανότητα ανάπτυξής τους σε μια πληθώρα από διαφορετικά ενδιαιτήματα, χρησιμοποιώντας ακόμα και λύματα, καθώς και η ικανότητά τους να παράγουν υψηλής αξίας προϊόντα την ίδια στιγμή, έχουν προσεγγίσει το ενδιαφέρον της ερευνητικής κοινότητας. Στην παρούσα μελέτη, μελετήθηκε ένα νέο στέλεχος κυανοβακτηρίου, απομονωμένου από τη λίμνη Παμβώτιδα. Η φυλογενετική του ανάλυση, το κατέταξε ως ένα στέλεχος Pseudanabaena sp., το οποίο ονοματίστηκε ως Pamv7. Τα κύτταρά του έχουν την ικανότητα να μεγαλώνουν τόσο σε αυτοτροφικές, όσο και ετεροτροφικές συνθήκες. Στην δεύτερη περίπτωση, μπορούν να μεγαλώσουν σε πληθώρα διαφορετικών υποστρωμάτων, αλλά όταν χρησιμοποιείται σελλοβιόζη, έχουν την ικανότητα να παράγουν β-γλυκοζιδάση. Το παρόν ένζυμο βρίσκει πληθώρα εφαρμογών στη βιομηχανία τροφίμων, αλλά και χαρτιού, χυμών, κρασιού κλπ, ενώ δεν έχει παραχθεί κατά το παρελθόν από το συγκεκριμένο τύπο μικροοργανισμών. Έτσι, μετά το φυλογενετικό χαρακτηρισμό του Pamv7 και της βιομηχανική του ανάλυσης, έλαβε χώρα μια αναλυτική μελέτη του ενζύμου. Αφού εξακριβώθηκε η παραγωγή του ενζύμου και της δράσης του, έλαβε χώρα η αριστοποίηση των συνθηκών ανάπτυξης (συγκέντρωση υποστρώματος, επιλογή πηγής αζώτου και συγκέντρωσής της, θερμοκρασία) του μικροοργανισμού και της παραγωγής του ενζύμου, με στόχο την αναβάθμιση της παραγωγής (scale-up). Χρησιμοποιώντας τις άριστες συνθήκες ανάπτυξης, έλαβε χώρα μεγαλύτερη παραγωγή του ενζύμου σε σύστημα βιοαντιδραστήρα 2L. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε ο καθαρισμός της παραγόμενης β-γλυκοζιδάσης και προσδιορίστηκε το μοριακό της βάρος και τα θερμοδυναμικά της χαρακτηριστικά. Το ένζυμο με μοριακό βάρος 66 kDa και ενζυμική ενεργότητα 40U/L, με βέλτιστη θερμοκρασία δράσης και pH τους 40oCκαι 6.0 αντίστοιχα, εμφανίζεται ιδιαιτέρως σταθερό στο εύρος του όξινου0ουδέτερου pHs (6.0-7.0), ιδιότητα που το κάνει ιδιαιτέρως χρήσιμο για χρήση στη βιομηχανία. Καθώς τα Pseudanabaena sp. κύτταρα είχαν την ικανότητα να παράγουν β-γλυκοζιδάση, γεννήθηκε το ερώτημα του αν θα μπορούσαν να παράγουν και άλλα ένζυμα, όπως η α-γλυκοζιδάση. Έτσι, χρησιμοποιώντας μαλτόζη ως πηγή άνθρακα, παράχθηκε α-γλυκοζιδάση με ενζυμική ενεργότητα περίπου 1800 U/L. Καθώς και η α-γλυκοζιδάση εμφανίζει πληθώρα εφαρμογών, η μελέτη συνεχίστηκε ως προς την αριστοποίηση των συνθηκών παραγωγής της. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας αυτές τις συνθήκες, έγινε η παραγωγή μεγάλης ποσότητας του ενζύμου σε σύστημα βιοαντιδραστήρα 2L, ο καθαρισμό του και η μελάτη των κινητικών και θερμοδυναμικών του χαρακτηριστικών. Η παραγόμενη α-γλυκοζιδάση είχε μοριακό βάρος 52 kDa, άριστες συνθήκες δράσης τους 40oC και το pH 7.0, αλλά σταθερότητα στην όξινη κλίμακα του pH (4.0-6.0), κάτι που την κάνει κατάλληλη για διεργασίες όπου χρησιμοποιούνται τέτοιες συνθήκες. Εκτός των παραπάνω, τα μικροφύκη και τα κυανοβακτήρια αποτελούν καλούς παραγωγούς λιπιδίων. Επιπλέον η περιβαλλοντική μόλυνση και ιδιαιτέρως το φαινόμενο του θερμοκηπίου, καθώς και η μείωση των φυσικών πόρων, έχει οδηγήσει στην αναζήτηση νέων, ανανεώσιμων μορφών ενέργειας, όπως το βιοντίζελ. Το γεγονός αυτό, σε συνδυασμό με την ικανότητα των κυανοβακτηρίων να χρησιμοποιούν ακόμα και λύματα ως υποστρώματα για την ανάπτυξή τους, έθεσε τα θεμέλια για την εφαρμογή ενός σχεδίου βιο-επεξεργασίας και βιο-οικονομίας, που μειώνει το περιβαλλοντικό αποτύπωμα, ενώ ταυτοχρόνως οδηγεί στην παραγωγή βιοντίζελ . Έτσι στην παρούσα διατριβή, τα κύτταρα χρησιμοποίησαν υδρολύματα από δύο σκανδιναβικά φυτά (silver birch and Norway spruce) για την ανάπτυξή τους και την παραγωγή λιπιδίων και βιοκαυσίμου. Η ανάλυση των παραγόμενων λιπιδίων υπέδειξε ένα λιπιδιακό προφίλ κατάλληλο για την παραγωγή βιοκαυσίμου, ενώ η ανάλυση των ιδιοτήτων του παραγόμενου βιοκαυσίμου υπέδειξε ικανοποιητική ποιότητα για πιθανή χρήση του. Τέλος τα κύτταρα Pseudanabaena sp. χρησιμοποιήθηκαν ως ‘εργοστάσια’ για την παραγωγή πολύ μικρών νανοσωματιδίων μέσω μιας πράσινης συνθετικής διαδικασίας. Το υδατικό εκχύλισμα του κυανοβακτηρίου δρα ως αναγωγικός και σταθεροποιητικός παράγοντας για τα Ag+ του AgNO3 προς τον σχηματισμό νανοσωματιδίων Agoκαι AgO. Επιπροσθέτων οι βιολογικές ενώσεις δρουν ως προστατευτικοί παράγοντες για τα νανοσωματίδια, προσδίδοντας τους πολλαπλές λειτουργίες. Τα μορφολογικά και δομικά χαρακτηριστικά τους προσδιορίστηκαν με τη χρήση τεχνικών όπως φασματομετρίες FTIR και XPS, X-ray Diffraction, μικροσκοπίες AFM και TEM. Επιπλέον τα παραγόμενα νανοσωματίδια εμφάνισαν εξαιρετικά ισχυρές αντιμοκροβιακές ιδιότητες που σχετίζονται άμεσα και με το χρόνο και με τη δόση, έναντι Gram-negativeEscherichiacoliκαιGram- positiveCorynebacteriumglutamicumβακτηριακών στελεχών (15μg/ml AgNPs (δηλ 3 μg/mlAg+ οδηγεί σε βακτηριακή μείωση πληθυσμού της τάξης του 95%). Εκτός από τις εφαρμογές όπου γίνεται χρήση της αντιμικροβιακής τους ικανότητας, τα νανοσωματίδια αργύρου μπουρούν να βρουν εφαρμογή και σαν νανοδομές σε περιβαλλοντικές, βιολογικές ή ιατρικές εφαρμογές. Συμπερασματικά, τα κύτταρα του κυανοβακτηρίου μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ‘εργοστάσιο’ για την παραγωγή μια πληθώρας βιομορίων και προϊόντων. Η παρούσα εργασία αποτελεί την πρώτη λεπτομερή έρευνα που αφορά την παραγωγή ενζύμων από τον συγκεκριμένο τύπο μικροοργανισμού. Επιπλέον τα κύτταρα εκυπηρετούν την ιδέα της βιοοικονομίας, καταναλώνοντας υπολείμματα και παράγοντας βιώσιμα και φιλικά προς το περιβάλλον καύσιμα. Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν ως εναλλακτική πλατφόρμα για την παραγωγή εξαιρετικά μικρών νανοσωματιδίων αργύρου, μέσω μιας διαδικασίας χαμηλού κόστους, γρήγορης και φιλικής προς το περιβάλλον.