Ex vivo ανάλυση της μετανάστευσης των ενδονευρώνων του φλοιού: ο ρόλος των μικρών GTPασών Rac1 και Rac3 στην οργάνωση του κυτταροσκελετού

Abstract

The correct function of cortical microcircuits depends in part on GABAergic interneurons that provide the main source of inhibition. Impaired interneuronal function results in severe neurodevelopmental disorders such as schizophrenia, epilepsy and autism. A pivotal process in the development of cortical interneurons, is their migration from the ventral telencephalon, where they originate towards the developing cortex. It is a process that is determined by intrinsic properties of the interneurons and extracellular factors, which modify their leading processes in response to them through activation of intracellular pathways. Rac-proteins are intracellular mediators of numerous developmental processes such as cytoskeleton organization, vesicle trafficking, transcription, cell cycle progression in diverse cell types. In the present study we focused in the role of the ubiquitously expressed Rac1 and the neural-specific Rac3 in interneurons derived from the medial ganglionic eminence (MGE), a population comprising the majority of cortical interneurons. Previous work from our lab uncovered, using Cre/loxP technology, a cell autonomous and stage-specific requirement for Rac1 activity within proliferating interneuron precursors (Vidaki et al., 2012). Mutant cortical interneurons aggregate ventrally due to defects in the actin organization in the leading processes and a delay in cell cycle progression of their progenitors. As a consequence, only 50% of interneurons populate the cortex postnatally. Mice deficient for Rac3 show no obvious developmental defects, while the results of behavioral tests revealed a hyperactive behavior, hypereactivity to the presentation of new stimuli and some differences in motor coordination and motor learning(Corbetta et al., 2005; Corbetta et al., 2008).The fact that the ablation of Rac3 did not severely affect cortical development, even though it is a nervous system-specific GTPase and also that the ablation of Rac1 from the MGE progenitors resulted in a severe, yet partial reduction of MGE-derived interneurons has led to the assumption that the two GTPases might compensate for each other’s loss. To clarify this hypothesis and overcome the difficulty that arises in exploring the role of Racs, the approach followed in this work, was to examine interneurons with both Racs absent. To do so, Rac1/Rac3 double mutant mice were generated by crossing Rac1 conditional KO with Rac3 KO animals.In the first part of this work the phenotype of the Rac1/Rac3 double mutants was described. The double ablation of Rac1/Rac3 leads to an even more severe reduction of cortical interneurons in the postnatal cortex. 80% of the ΜGE-derived interneurons fail to migrate to the cortex due to a delay in the cell cycle exit (of the same extent as the one described in Rac1 single mutants) and cytoskeletal defects. In fact, Rac1/Rac3-deficient interneurons exhibit gross cytoskeletal abnormalities, due to impairments in actin-microtubule dynamics, including reduction of axon length, splitting of the leading process, abnormal growth cone formation and reduction of microtubule stability (Tivodar et al., 2015). Pharmacological treatment of the interneurons with taxol, a reagent that stabilizes microtubules, improved the described features described and partially rescued the phenotype of the cells.As migration of the Rac1/Rac3 double mutant interneurons was impaired, a process that requires constant cytoskeletal reorganization, in the second part of this work the migratory behavior of interneurons was analyzed by time lapse microscopy. Several aspects of their movement, like velocity, frequency of translocation, amplitude of translocation and others were found affected. The subcellular localization of the centrosome and Golgi complex, key elements of proper migration, were altered in the absence of Rac1/Rac3 and also actomyosin dynamics was impaired, explaining the deficits in their migratory behavior. Moreover, axon outgrowth, the initiation of this process and also axonal transport, as evidenced by lysosomal locomotion were significantly impacted. Lysosomal positioning was also found affected during the migration of the cells. RNA-sequencing revealed a number of genes with altered expression in MGE-derived interneurons upon ablation of Rac1 and Rac3. Among them the two-pore channel 2 (TPCN2 encoding TPC2), a member of the superfamily of voltage-gated ion channels, that is mainly located in late endosomes/lysosomes and mediates Ca2+ release (Marchant and Patel, 2015; Patel and Kilpatrick, 2018). The protein levels of TPC2 were found reduced and its subcellular localization was affected. Lastly, pharmacological inhibition of TPC2 in wild type interneurons severely affected their axon growth and the initiation of this process, similarly to the ablation of Rac1/3. Pharmacological inhibition of TPC2 also affected the migration as the velocity and the frequency of translocation were found decreased. Collectively, these data support the idea that reduction of TPC2 upon ablation of Rac1 and Rac3 in cortical interneurons could contribute to the phenotype observed regarding the initiation of axon outgrowth, axon extension and interneuron migration.

Η σωστή λειτουργία του φλοιού εξαρτάται κατά ένα μέρος, από τους GABAεργικούς ενδονευρώνες που παρέχουν την κύρια πηγή αναστολής. Η μη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων αυτών έχει συσχετιστεί με σοβαρές νευροαναπτυξιακές διαταραχές, όπως είναι η σχιζοφρένεια, η επιληψία, η νοητική υστέρηση και οι διαταραχές του φάσματος του αυτισμού. Μια κομβικής σημασίας διαδικασία στην ανάπτυξη των ενδονευρώνων, είναι η μετανάστευσή τους από τον κοιλιακό τελεγκέφαλο, όπου γεννιούνται, προς τον αναπτυσσόμενο φλοιό. Η διαδικασία αυτή καθορίζεται από τις εγγενείς ιδιότητες των ενδονευρώνων καθώς και από εξωκυτταρικούς παράγοντες, που τροποποιούν την καθοδηγητική τους απόφυση ως απόκριση στους παράγοντες αυτούς, μέσω της ενεργοποίησης ενδοκυττάριων μονοπατιών. Οι Rac πρωτεΐνες αποτελούν τους ενδοκυτταρικούς μεσολαβητές για πολυάριθμες αναπτυξιακές διεργασίες, όπως η οργάνωση του κυτταροσκελετού, η μετακίνηση των κυστιδίων, η μεταγραφή, η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, σε διάφορους τύπους κυττάρων.Στην παρούσα μελέτη επικεντρωθήκαμε στον ρόλο της Rac1 η οποία εκφράζεται σε όλους τους ιστούς και της νευροειδικής Rac3, στους ενδονευρώνες που προέρχονται από την έσω γαγγλιονική προεξοχή (MGE). Από την περιοχή αυτή προέρχεται η πλειοψηφία των ενδονευρώνων του φλοιού. Προηγούμενη εργασία από το εργαστήριό μας αποκάλυψε, χρησιμοποιώντας την τεχνολογία Cre/loxP, ότι η Rac1 GTPάση είναι απαραίτητη σε ένα πρώιμο στάδιο της ανάπτυξης των ενδονευρώνων, στα προγονικά τους κύτταρα (Vidaki et al., 2012). Οι ελλειμματικοί για τη Rac1 ενδονευρώνες βρέθηκαν να συσσωρεύονται στον κοιλιακό τελεγκέφαλο λόγω επιπτώσεων στην οργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης στις καθοδηγητικές τους αποφύσεις και λόγω καθυστέρησης στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των πρόδρομων κυττάρων τους. Σαν αποτέλεσμα μόνο το 50% των ενδονευρώνων εντοπίζονται στο φλοιό μεταγεννητικά. Τα ποντίκια με έλλειψη στη Rac3, δεν αντιμετωπίζουν εμφανή προβλήματα κατά την ανάπτυξή τους, ενώ με δοκιμές συμπεριφοράς προέκυψε ότι παρουσιάζουν υπερκινητική συμπεριφορά, υπεραντιδραστικότητα στην παρουσίαση νέων ερεθισμάτων και κάποιες διαφορές στον κινητικό συντονισμό και την κινητική μάθηση (Corbetta et al., 2005; Corbetta et al., 2008).Το γεγονός ότι η αφαίρεση της Rac3 δεν επηρέασε σοβαρά την ανάπτυξη του φλοιού, παρόλο που η ίδια είναι μια νευρο-ειδική GTPάση καθώς και το ότι, η αφαίρεση της Rac1 από τα πρoγονικά κύτταρα των ενδονευρώνων του MGE είχε ως αποτέλεσμα μια σοβαρή μεν, αλλά μερική μείωση των ΜGE-προερχόμενων ενδονευρώνων, οδήγησε στην υπόθεση ότι οι δύο GTPases μπορεί να αντισταθμίζουν η μία την απώλεια της άλλης. Για να διερευνηθεί η ορθότητα της υπόθεσης αυτής και ταυτόχρονα να ξεπεραστεί η δυσκολία που προκύπτει στην μελέτη του ρόλου των Racs, η προσέγγιση που ακολουθήθηκε σε αυτή την εργασία, ήταν να εξεταστούν οι ενδονευρώνες απουσία των δύο Rac GTPασών. Για να επιτευχθεί αυτό, δημιουργήθηκαν Rac1/Rac3 διπλά ελλειμματικοί μύες. Tα ζώα αυτά προέκυψαν από διασταύρωση μυών στα οποία η Rac1 απαλείφονταν μόνο από τους ενδονευρώνες που προέρχονται από το MGE με ζώα που δεν εξέφραζαν καθόλου τη Rac3 πρωτεΐνη. Στο πρώτο μέρος αυτής της εργασίας περιγράφηκε ο φαινότυπος των Rac1/Rac3 διπλά ελλειμματικών ζώων. Η ταυτόχρονη αφαίρεση των Rac1/Rac3 οδηγεί σε ακόμη πιο σοβαρή μείωση των ενδονευρώνων στο φλοιό μεταγεννητικά. Το 80% των MGE-προερχόμενων ενδονευρώνων αποτυγχάνουν να μεταναστεύσουν προς τον φλοιό λόγω καθυστέρησης στην έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο – καθυστέρηση ίδιας έκτασης με αυτή που περιγράφεται στο Rac1 ελλειμματικά ζώα- και ανωμαλιών στον κυτταροσκελετό τους. Στην πραγματικότητα, οι ενδονευρώνες με έλλειψη Rac1/Rac3 εμφανίζουν μεγάλες κυτταροσκελετικές αλλαγές, λόγω διαταραχών στη δυναμική της ακτίνης και των μικροσωληνίσκων. Οι βασικές αλλαγές που παρατηρούνται στη μορφολογία τους είναι: μείωση του μήκους του άξονα, καθοδηγητική απόφυση έντονα διακλαδισμένη, μη φυσιολογικός σχηματισμός του αυξητικού κώνου και μείωσης της σταθερότητας των μικροσωληνίσκων (Tivodar et al., 2015). Παρουσία taxol, ενός αντιδραστηρίου που σταθεροποιεί τους μικροσωληνίσκους, τα χαρακτηριστικά που περιγράφηκαν βελτιώνονται σημαντικά και ο φαινότυπος των κυττάρων διασώζεται τουλάχιστον εν μέρει. Καθώς η μετανάστευση των διπλά ελλειμματικών για τις Rac ενδονευρώνων βρέθηκε να επηρεάζεται και η μετανάστευση είναι μια διαδικασία στην οποία απαιτείται η συνεχής κυτταροσκελετική αναδιοργάνωση, στο δεύτερο μέρος αυτής της εργασίας αναλύθηκε η μεταναστευτική συμπεριφορά των ενδονευρώνων, καταγράφοντας με μικροσκοπία την κίνηση των ζωντανών κυττάρων. Αρκετές πτυχές της κίνησής τους, όπως η ταχύτητα, η συχνότητα μετατόπισης, το πλάτος της μετατόπισης και άλλες, βρέθηκαν να μειώνονται. Ο υποκυτταρικός εντοπισμός του κεντροσώματος και του συμπλέγματος Golgi, που είναι και τα δύο βασικά στοιχεία, απαραίτητα για τη σωστή μετανάστευση, άλλαξαν, απουσία Rac1/Rac3. Επίσης η δυναμική της ακτομυοσίνης διαταράχθηκε, εξηγώντας τα ελλείμματα που παρατηρήθηκαν στη μεταναστευτική συμπεριφορά των ενδονευρώνων. Επιπλέον, η ανάπτυξη του άξονα, η έναρξη της επιμήκυνσής του και η αξονική μεταφορά, όπως δείχθηκε καταγράφοντας την κίνηση των λυσοσωμάτων, επηρεάστηκαν επίσης σημαντικά. Η τοποθέτηση των λυσοσωμάτων κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης των ενδονευρώνων βρέθηκε να διαφοροποιείται απουσία των δύο Rac. Πραγματοποιήθηκε RNA-αλληλούχηση και αποκαλύφθηκε ένας αριθμός γονιδίων των οποίων η έκφραση στους ΜGE-προερχόμενους ενδονευρώνες τροποποιείται μετά την απομάκρυνση των Rac1 και Rac3. Ανάμεσά τους το γονίδιο TPCN2 που κωδικοποιεί το δίαυλο TPC2, έναν τασεο-ελεγχόμενο δίαυλο ιόντων, που βρίσκεται κυρίως στα όψιμα ενδοσώματα και στα λυσοσώματα και επιτρέπει την απελευθέρωση Ca2+ (Marchant and Patel, 2015; Patel and Kilpatrick, 2018). Τα επίπεδα πρωτεϊνών του TPC2 βρέθηκαν μειωμένα και ο υποκυτταρικός εντοπισμός του βρέθηκε επίσης να τροποποιείται. Τέλος, η φαρμακολογική αναστολή του TPC2 σε ενδονευρώνες άγριου τύπου επηρέασε σοβαρά την ανάπτυξη των νευραξόνων τους και την έναρξη αυτής της διαδικασίας, παρόμοια με ότι παρατηρείται στους ενδονευρώνες απουσία των Rac1/3. Η φαρμακολογική αναστολή του TPC2 επηρέασε επίσης τη μετανάστευση των ενδονευρώνων με την ταχύτητα και η συχνότητα της μετατόπισης να μειώνονται.Συνολικά τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι η μείωση του TPC2 κατά την αφαίρεση των Rac1 και Rac3 στους ενδονευρώνες του φλοιού θα μπορούσε να συμβάλει στον φαινότυπο που παρατηρήθηκε όσον αφορά την επιμήκυνση του άξονα, την έναρξη της ανάπτυξής του και τη μετανάστευσης των ενδονευρώνων.